摘要
使用抗生素是一种有效治疗细菌性传染病的方法，但近年来滥用抗生素已经导致更多的细菌产生耐药性或成为超级细菌。抗生素耐药性已经成为世界上最紧迫的健康问题之一。随着时间的推移，人类可能不能拥有足够有效力的抗生素，更多的人可能会死于细菌感染。 抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMP）存在于多种生物体内，是抵抗病原微生物入侵的重要手段。它是小分子肽类物质，由10~100个氨基酸残基组成，分子量约为2000~7000Da，具有一定的生物活性。Cathelicidin作为结构多样性最大的抗菌肽家族之一，至少有4亿年的历史。在哺乳动物、鱼类、鸟类、两栖动物和爬行动物等中广泛存在。研究表明在毒蛇和非毒蛇中均存在抗菌肽，包括KR(F/A)KKFFKK(L/P)K保守结构区域。蛇Cathelicidin对病原微生物有一定的杀灭效果，但具体机制尚不十分清楚。 尖吻蝮蛇是我国特有的毒蛇之一，也是药典收录的可以入药的三种蛇类之一。目前对尖吻蝮蛇的研究主要集中在抗毒蛇咬伤、凝血酶及抗血小板聚集等方面。但是尖吻蝮蛇相关抗菌肽物质的研究尚未见报道。尖吻蝮蛇相关抗菌肽物质的研究和开发，对蛇类资源的充分利用及新抗生素的开发具有重要意义。 1.本文运用生物信息学分析技术，在尖吻蝮蛇基因组中发现了蛇类抗菌肽Cathelicidin家族的新成员FP-CATH。FP-CATH由34个氨基酸组成，N端第7位氨基酸为色氨酸。圆二色谱检测化学合成的FP-CATH的结构，在水相条件下为无规则卷曲结构，膜模拟条件下为α螺旋结构。在体外，通过MIC/MBC实验表明，FP-CATH对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌都有杀菌作用，可在30min内快速杀伤革兰氏阴性菌。人红细胞溶血实验及细胞毒性实验表明，其具有较低的溶血活性和细胞毒性。在体内，FP-CATH可以提高液体致死模型中线虫的生存率。 2.FP-CATH的主要抗菌机制是影响细菌膜的完整性。扫描电镜及透射电镜结果显示，FP-CATH处理后细菌膜的完整性受到影响。外膜及内膜渗透性实验进一步证实细菌膜的完整性被破坏。微量热泳动实验表明FP-CATH能与革兰氏阴性菌膜上的LPS成分特异结合，Kd值为1.31±0.30μM。H-Dock分析和多肽截短实验进一步表明，FP-CATH的N端是与LPS结合的主要区域，主要发挥功能区为FWKKIKNSVKKRAKKF，ITC测定了其与LPS的亲和力，Kd值为0.659±0.266μM。荧光定量PCR结果表明FP-CATH影响细菌LPS合成、运输基因以及重要膜蛋白基因的转录水平；FP-CATH还可以和细菌DNA结合。在肽/DNA质量比为0.31:1条件下，细菌基因组的DNA的电泳迁移率可以被FP-CATH抑制。FP-CATH可以导致recA基因转录水平升高，诱导细菌SOS反应。相对于野生型菌株，recA基因敲除菌株对FP-CATH更为敏感，但是过表达recA基因不影响FP-CATH的抗菌作用。 3.FP-CATH通过诱导革兰氏阴性菌ROS水平的升高，发挥杀菌作用。FP-CATH可以诱导细菌sodA等ROS解毒基因转录水平的表达。相对于野生型菌株，sodA基因敲除菌株对FP-CATH更为敏感。过表达sodA基因使FP-CATH的MIC值相对于野生型提高2倍。FP-CATH杀菌机制与干扰细菌氧化还原反应系统有一定的关系。 综上所述，本研究发现了蛇类抗菌肽家族的新成员FP-CATH，具有较广谱的抗菌活性、快速杀伤革兰氏阴性菌和较低的毒性。FP-CATH的主要抗菌机制是影响细菌膜的完整性，能与革兰氏阴性菌膜上的LPS成分特异结合。FP-CATH的次要抗菌机制是结合细菌DNA，干扰细菌正常代谢。FP-CATH还可以诱导革兰氏阴性菌ROS的升高，干扰细菌氧化还原稳态。通过对FP-CATH的抗菌机制的研究，有助于尖吻蝮蛇类资源的充分利用，全面理解其抗菌机理，可以为抗生素的开发提供理论依据。
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