炒制用米对党参化学成分和药效的影响研究

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中文摘要：目的党参是传统补益类中药，米炒党参是其常用的炮制品，对于治疗脾气虚疗效显著，并被历版《中国药典》收载。为了明确米炒党参炮制用米种类，阐明各自特点，本研究以党参及不同米炒党参主要化学成分含量、建立指纹图谱及对脾虚大鼠药效与肠道菌群影响进行比较、分析，阐明不同米制党参成分及药效异同，进而为丰富米炒党参炮制内涵和完善炮制规范奠定基础。方法1.党参和不同米炒制党参主要化学成分含量比较采用热浸法测定醇溶性浸出物含量，HPLC法测定5-羟甲基糠醛（5-HMF）和党参炔苷含量，苯酚-浓硫酸法测定党参多糖含量，进而对不同米炒党参的主要化学成分进行比较。 2.党参和不同米炒制党参指纹图谱研究采用UPLC法，色谱柱为AgilentPoroshellSB-C18，流动相为乙腈-0.15%冰醋酸水（梯度洗脱），流速为0.3mL/min，检测波长为267nm，柱温为30℃，进样量为1μL。以党参炔苷为参照，建立党参、小米炒党参、大米炒党参（各9批）的UPLC指纹图谱，运用《中药指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行相似度评价，运用SPSS20.0软件进行聚类分析和主成分分析。基于上述色谱条件，采用UPLC-Q-Exactive-MS/MS液质联用技术，质谱采用正、负离子模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描功能，对党参及不同米炒党参的化学成分进行快速分离和鉴定。 3.党参与不同米炒制品对脾虚大鼠的药效研究采用大黄苦寒泻下、劳倦过度、饥饱失常等三因素联合诱导SD大鼠造成脾虚模型。分别灌胃党参、小米炒党参和大米炒党参煎液，对脾虚大鼠体质量增重，最后一次游泳时长、肌酸激酶（CK）含量，D-木糖排泄率、小肠推进率、胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）、血管活性肠肽（VIP）、生长抑素（SS）等胃肠道功能相关指标，脾脏指数、胸腺指数、白细胞总数、CD4+/CD8+比值、免疫球蛋白G（IgG）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）含量等免疫功能相关指标，水通道蛋白3（AQP3）和Na+-K+-ATP酶含量等水液代谢相关指标进行检测，比较不同米炒党参功效的异同。 4.党参和不同米炒党参肠道菌群差异分析实验动物造模及给药方法同上述药效比较，给药最后一天，采集各组大鼠粪便样本，提取粪便样本总DNA，根据细菌16SrRNAV3~V4可变区设计引物进行扩增，应用IlluminaMiseq平台进行高通量测序，对细菌群落组成的丰富度和多样性进行比较分析。结果1.党参和不同米炒制党参主要化学成分含量比较（1）醇溶性浸出物潞党参醇溶性浸出物含量依次为大米炒党参＞小米炒党参＞党参；经不同基源验证，素花党参、川党参醇溶性浸出物含量依次均为小米炒党参＞大米炒党参＞党参，变化趋势不一致。（2）5-HMF 潞党参5-HMF含量依次为大米炒党参＞小米炒党参＞党参；经不同基源验证，素花党参5-HMF含量变化趋势与潞党参一致，而川党参5-HMF含量依次为小米炒党参≈大米炒党参＞党参，变化趋势不一致。（3）党参多糖潞党参多糖含量依次为大米炒党参＞党参＞小米炒党参；经不同基源验证变化趋势一致。（4）党参炔苷潞党参炔苷含量依次为党参＞小米炒党参＞大米炒党参；经不同基源验证，素花党参、川党参炔苷含量依次均为小米炒党参＞大米炒党参＞党参，变化趋势不一致。 2.党参和不同米炒制党参指纹图谱研究通过对供试品溶液制备方法及色谱条件的优化，建立党参、小米炒党参、大米炒党参的UPLC特征图谱，并进行方法学考察，表明方法稳定可行。9批党参生品的UPLC指纹图谱有6个共有峰，小米炒党参和大米炒党参分别均有10个共有峰，相似度均大于0.90；指认了5-HMF、党参炔苷2个共有峰，党参“米”炒后UPLC指纹图谱共有峰特征明显，色谱峰3、5、6、7的峰面积显著增加；与小米炒党参指纹图谱对比，大米炒党参指纹图谱中除色谱峰6、7峰面积基本一致外，其余色谱峰峰面积均相对较大。聚类分析和主成分分析结果显示，9批党参生品聚为1类，而小米炒党参和大米炒党参聚为1类。采用UPLC-Q-Exactive-MS/MS技术，并结合数据库和文献共鉴定出41种化学成分，其中15种为首次在该植物中报道。化学成分主要以内酯类、有机酸类和苯丙素类化合物为主，其中脱落酸、丁香醛、木犀草素和咖啡酸是党参中特有的成分；乳糖、6-姜酚是小米炒党参中特有的成分；(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、栎樱酸、腺嘌呤、木犀草苷只存在于党参和大米炒党参中；5-羟甲基糠醛存在于小米炒党参和大米炒党参中。 3.党参与不同米炒制对脾虚大鼠的药效研究各给药组均能增加脾虚大鼠的体质量，改善胃肠道功能、免疫功能、水液代谢指标，对脾虚均有一定的治疗作用。与模型组相比，不同米炒党参组最后一次游泳时长、CK含量、D-木糖排泄率、小肠推进率、GAS、MTL、VIP、脾脏指数、胸腺指数、白细胞总数、AQP3和Na+-K+-ATP酶的含量均不同程度上升；SS、IgG、TNF-α含量和CD4+/CD8+比值均不同程度降低，说明不同米炒党参均能不同程度地改善大鼠脾虚症状。在调节胃肠道功能方面，与小米炒党参组相比，大米炒党参组GAS含量更高，有显著性差异（P＜0.05）；两组对体质量增重、小肠推进率和尿D-木糖排泄率、MTL、VIP、SS比较虽无显著性差异，但小米炒党参组大鼠增重更加明显，MTL、VIP含量更高；而大米炒党参组小肠推进率和尿D-木糖排泄率更高，SS含量较低。在调节免疫功能方面，与小米炒党参组相比，大米炒党参组胸腺指数较高、IL-6含量较低（P＜0.05），脾脏指数和TNF-α含量较低，白细胞总数、CD4+/CD8+比值和IgG含量较高，但无显著性差异（P＞0.05）。在调节水液代谢方面，与小米炒党参组相比，大米炒党参组Na+-K+-ATP酶含量较低（P＜0.05），AQP3含量较高但无显著性差异（P＞0.05）。 4.党参和不同米炒党参肠道菌群差异分析五个组总计30个样本，共获得1800324条有效序列，48232个OTU。经主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）和基于β多样性距离的非度量多维尺度分析（NMDS），结果显示空白组与模型组、模型组与3个给药组大鼠肠道菌群组成存在明显差异；在门水平上，5个组的优势菌群均为厚壁菌门，次优势菌群为拟杆菌门；在属水平上，5个组的优势菌群均为乳杆菌属，次优势菌群为鼠杆菌属，小米炒党参组与大米炒党参组两者间菌群结构和相对丰度无较大差异。结论大小米炒制对党参的主要化学成分含量和指纹图谱展现的整体化学成分有一定差异。大小米炒党参对脾虚大鼠均有一定的改善作用，然两者在调节指标方面各有优势，其中，大米炒党参更有助于调节消化道功能并维持消化道结构的完整性，也更有助于增强脾虚大鼠免疫功能；小米炒党参则更有助于调节脾虚大鼠水液代谢功能，同时，党参和及米炒制党参可调节脾虚大鼠的肠道菌群。

作者：

王梅

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关键词：

党参炒制用米化学成分指纹图谱 UPLC-Q-Exactive 药效试验肠道菌群

授予学位：

硕士

学科专业：

中药学

导师：

倪艳

学位年度：

2021

学位授予单位：

山西中医药大学

语种：

中文

中图分类号：