摘要
目的：基于PI3K/Akt/mTOR信号通路研究小青龙汤方证机制，通过网络药理学预测和筛选小青龙汤方证的靶点和小青龙汤可能作用机制，实验验证小青龙汤是否通过调节PI3K/AKT信号通路发挥其治疗作用。 方法：1.通过网络药理学预测和筛选小青龙汤方证的靶点和小青龙汤潜在的作用机制：借助中药系统药理学数据库与分析平台（TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform，TCMSP）平台收集小青龙汤的活性化合物及其作用靶点；借助在线人类孟德尔遗传（OnlineMendelianInheritanceinMan，OMIM）数据库和基因组注释数据平台（genomeannotationdatabaseplatform，GeneCards）收集慢性支气管炎、支气管哮喘和上呼吸道感染三种疾病的靶点，通过韦恩图2.1确定交集基因；将交集基因导入String11.0平台，构建蛋白质相互作用（proteinproteininteraction，PPI）网络；利用DAVID6.7数据库和OmicshareTool软件进行基因本体（geneontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）富集分析。 2.建立小青龙汤证大鼠模型，设置空白组、模型组、小青龙汤高、中、低剂量组，观察大鼠一般状态、体质量和大鼠肺组织病理形态学改变。ELISA法检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）水平。实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）检测大鼠肺组织中PI3K、Akt、mTORmRNA相对水平。蛋白质印迹法（WesternBlot）检测大鼠肺组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白水平。 结果：1.获得有效化合物169种，药物靶点1105个，疾病靶点824个；得到潜在靶标254个，通过构建“化合物-靶点”网络图，确定小青龙汤治疗慢性支气管炎、支气管哮喘和上呼吸道感染的核心成分110个、核心靶点106个。核心成分包括山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）、豆甾醇（Stigmasterol）、华良姜素（Jaranol）、谷甾醇（sitosterol）、黄芩素（baicalein）、刺果甘草查耳酮（Glypallichalcone）、去氧三尖杉脂碱（Deoxyharringtonine）等；核心靶点包括ESR1、ESR2、ACHE、CDK2、EGFR、ABCG2ABCB1、CCNB1、MMP13、MMP3等。KEGG富集分析显示潜在作用通路为PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、HIF-1信号通路、ErbB信号通路、Ras信号通路、FoxO信号通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路和TNF-α信号通路。 2.大鼠一般情况结果：造模过程中，模型组死亡1只，其余各组造模成功。各组大鼠相对于空白组大鼠均出现咳嗽、呼吸急促、喘息、打喷嚏、饮食减少、反应迟钝、行动迟缓、爱扎堆、立毛、拱背、蜷曲等情况。大鼠体质量变化情况：与空白组相比，模型组与小青龙汤治疗组大鼠体质量在造模后增加不明显，甚至出现负增长（P＜0.01）；经过药物干预治疗后，与空白组相比，模型组大鼠体质量增长仍不明显（P＞0.05），与模型组相比，小青龙汤高低剂量组大鼠体质量均明显增加（P＜0.01）。大鼠肺组织病理学表现：空白组大鼠肺组织结构无明显异常，肺泡结构规则完整，呈空泡状薄壁结构，肺泡壁结构清晰，无明显炎性细胞浸润。模型组大鼠肺泡间隔增宽，肺泡腔缩小甚至塌陷，部分肺泡腔扩张，肺泡间质和支气管壁炎性细胞浸润，多为淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。给予小青龙汤干预后，小青龙汤高剂量组与小青龙汤中剂量组肺泡腔缩小塌陷改善、肺泡间质增宽以及炎性细胞浸润减少，但是难以恢复到空白组大鼠肺组织的结构状态。RT-qPCR结果显示与空白组比较，模型组PI3K、AKT、mTOR的mRNA相对表达升高（P＜0.05）；与模型组相比，小青龙汤高剂量组PI3K、Akt、mTOR的mRNA相对表达降低（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，小青龙汤中、低剂量组PI3K、Akt、mTORmRNA表达降低，但无统计学意义（P＞0.05）。ELISA结果显示，与空白组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，小青龙汤中剂量组和小青龙汤高剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，小青龙汤低剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8水平降低，但无统计学意义（P＞0.05）。Westernblot结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，小青龙汤中剂量组和小青龙汤高剂量组大鼠肺组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，小青龙汤低剂量组大鼠肺组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白水平降低，但无统计学意义（P＞0.05）。 结论：（1）本次研究基于网络药理学预测了小青龙汤方证的作用靶点，得到小青龙汤证的疾病靶点824个，小青龙汤方作用的核心成分110个，核心靶点106个。小青龙汤的作用机制与PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、HIF-1信号通路、ErbB信号通路、Ras信号通路、FoxO信号通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路和TNF-α信号通路相关。 （2）小青龙汤证的发生发展与PI3K/Akt/mTOR信号通路调控的炎症和免疫反应相关，而小青龙汤能够通过下调PI3K、AKT、mTOR的蛋白和mRNA的相对表达，抑制血清中的促炎因子和肺组织中炎症细胞的浸润，改善肺部炎症，以高剂量组最为明显。
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