摘要
目的：采用网络药理学联合人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）体外模型，探讨鹿角霜能否通过干预TGF-β信号通路抑制肿瘤干细胞样特性发挥抗肿瘤作用，为补肾类中药鹿角霜在乳腺癌预防及治疗的临床应用提供理论依据。 方法： 1.采用中医药数据库BATMAN-TCM和中国知网收集鹿角霜的化学成分信息，利用BATMAN-TCM和TCMSP数据库预测各化学成分的潜在靶点，用GeneCards数据库获取乳腺癌干细胞靶点，二者取交集获得鹿角霜干预乳腺癌干细胞潜在靶点，用String数据库对潜在靶点进行蛋白互作分析，获得鹿角霜干预乳腺癌干细胞关键靶点和化合物，利用Metascape数据库进行GO和KEGG通路注释分析，利用Cytoscape3.8.0软件对鹿角霜干预乳腺癌干细胞的药物-成分-靶点-通路构建网络图，并进行分析。 2.将细胞分为四组，空白对照组、0.2mg?mL-1鹿角霜含药血清处理组、0.4mg?mL-1鹿角霜含药血清处理组和0.6mg?mL-1鹿角霜含药血清处理组。培养24h后显微镜下观察细胞形态并记录；采用CCK-8细胞增殖实验检测鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231増殖程度的影响；采用软琼脂集落形成实验检测鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231集落形成能力的影响；采用实时荧光定量方法检测鹿角霜含药血清作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后TGF-β信号通路中TGFBR1和SMAD2的mRNA转录水平；采用WesternBlot方法检测鹿角霜含药血清作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后TGF-β信号通路中TGFBR1和SMAD2的蛋白表达水平。 结果： 1.从BATMAN-TCM数据库和知网获得鹿角霜成分33个，从BATMAN-TCM和TCMSP数据库获得鹿角霜潜在靶点16377个，从GeneCards数据库获得乳腺癌干细胞靶点688个，将鹿角霜和乳腺癌靶点取交集后获得共有靶点503个，用String数据库对503个共有靶点进行蛋白互作分析，筛选得到20个核心靶点IL6、VEGFA、GAPDH、STAT3、INS、TNF、CXCL8、AKT1、MAPK3、MYC、MAPK1、TP53、FN1、CASP3、MMP9、JUN、CXCR4、EGF、SRC、NOTCH1及其相对应的6个关键化合物磷酸钙、碳酸钙、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸，利用Metascape数据库对503个共有靶点进行基因功能分析，得到生物学过程3938条，主要参与了调节细胞粘附、调节蛋白激酶活性、淋巴细胞活化、转移酶活性的正调控、血管发育、细胞群增殖的负调控、激酶活性的正调控、血管发育、MAPK级联的调节、白细胞分化等；细胞组分208条，主要参与了膜的侧面、受体复合物、细胞质核周区、膜筏、膜微区、质膜蛋白复合物、质膜外侧、粘着、细胞-基底连接、转移酶复合物等；分子功能326条，主要是激酶结合、转录因子结合、激酶活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶结合、磷酸转移酶活性，醇基为受体、蛋白激酶活性、受体调节活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性等。京都基因本体论分析170条，主要是癌症的途径、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、乳腺癌、细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路、刺猬信号通路、Notch信号通路等。通过鹿角霜干预乳腺癌干细胞的药物-成分-靶点-通路网络图说明鹿角霜可以通过“多成分-多靶点-多通路”来干预乳腺癌干细胞。 2.鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231形态的影响 与空白对照组相比，鹿角霜含药血清组的MDA-MB-231细胞数量明显减少，存活能力下降，细胞稀落，形态不规则，体积明显缩小，部分细胞脱落，悬于培养液之中。 3.鹿角霜含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231増殖的影响 CCK-8细胞增殖实验结果显示，与空白对照组相比，0.2mg?mL-1、0.4mg?mL-1、0.6mg?mL-1三种不同浓度鹿角霜含药血清均可以抑制乳腺癌细胞增殖（Plt;0.05），而浓度为0.6mg?mL-1的鹿角霜含药血清对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用最显著；软琼脂集落形成实验结果显示，三种不同浓度鹿角霜含药血清均可以抑制乳腺癌细胞集落形成数（Plt;0.05），而0.6mg?mL-1的鹿角霜含药血清对细胞集落形成数的抑制作用最显著。 4.鹿角霜含药血清对TGF-β信号通路中TGFBR1、Smad2表达量的影响 实时荧光定量实验结果显示，与空白对照组相比，0.2mg?mL-1、0.4mg?mL-1、0.6mg?mL-1三种不同浓度鹿角霜含药血清干预24h后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中TGFBR1、Smad2mRNA转录水平显著降低（Plt;0.01）；WesternBlot实验结果显示，与空白对照组相比，0.2mg?mL-1、0.4mg?mL-1、0.6mg?mL-1三种不同浓度鹿角霜含药血清干预24h后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中TGFBR1、Smad2蛋白表达水平显著降低（Plt;0.01）。 结论：本研究从网络药理学和体外细胞模型中发现，鹿角霜不同浓度含药血清中的多个组分，能够协同作用于乳腺癌干细胞的目标差异表达基因，并通过下调TGF-β通路中关键分子TGFBR1及下游信号Smad2蛋白的表达水平，抑制乳腺癌细胞增殖，amp;nbsp;发挥抗乳腺癌作用。
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