摘要
水貂阿留申病（Aleutianminkdisease,AMD）是由水貂阿留申病毒（Aleutianminkdiseasevirus,AMDV）引起的一种慢性传染性疾病，以水貂的繁殖障碍和免疫抑制为主要特征。貂群中AMDV可以通过水平和垂直两种方式传播，一旦感染会造成严重的经济损失。目前，该病的防控尚未出现有效疫苗，预防水貂阿留申病最好的措施是“源头控制”、“早发现、早剔除”，及时净化种群。目前已建立了多种AMDV的检测方法，如ELISA、对流免疫电泳法、荧光定量PCR等，但仍满足不了该病的防控。“早诊断、早发现”从而实现水貂种质资源筛选和保护的技术需求。本实验研究建立了AMDV微滴式数字PCR（dropletdigitalPCR,dd-PCR）定量检测方法，该方法具有灵敏度高、易定量等特点。通过对养殖场临床样品和环境样品的检测应用，表明该方法能够通过粪便棉拭子样品和环境样品的检测实现病原的早发现，为水貂引种、阿留申病净化和种质资源保护提供了技术支撑。 1.AMDV的dd-PCR检测方法的建立 根据AMDV经典毒株ADV-G毒株的基因全长，设计PCR扩增引物，并成功扩增出VP2基因，连接转化后构建到pMD18-T载体上，成功制备AMDV质粒标准品。参考山东省地方标准（标准号DB/T4204-2020）里的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测方法的引物探针，在此基础上对引物探针的浓度、退火温度、升降温速率等进行优化，开展了针对微滴式数字PCR的灵敏性试验、特异性试验、重复性试验，最终建立了AMDV的dd-PCR检测方法。与山东地方标准里发布的AMDV的RT-qPCR检测方法做比较，以质粒标准品为样本，两种试验方法的线性关系表明：dd-PCR（R2=1）和RT-qPCR（R2=0.994）均具有良好的线性关系；灵敏性试验结果显示：RT-qPCR的最低检测量是143copies/μL，dd-PCR的最低检测量约为1.43copies/μL；特异性试验结果显示：dd-PCR检测AMDV为阳性，水貂肠炎细小病毒（MEV）、犬瘟热病毒（CDV）和水貂流感病毒（MIV）等其他病毒均为阴性；重复性试验表明：组内实验和组间实验的变异系数（CV%）均小于3%。因此，该检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的优点。 2.AMDV的dd-PCR检测方法的初步应用 收集507份来自疑似发病水貂场的临床样品，使用本试验建立的dd-PCR检测方法与山东省地方标准建立的RT-qPCR检测方法分别进行核酸检测，结果检出总的阳性率分别为40.63%（206份）和26.43%（134份）。其中，261份组织样品的检出核酸阳性率分别为41.76%（109份）和34.86%（91份），246份环境样品的检出核酸阳性率分别为39.43%（97份）和17.48%（43份），表明dd-PCR具有更高的灵敏度，能够对粪便棉拭子和环境样品等病毒含量低的样本进行有效检测。用Kappa方法对dd-PCR与RT-qPCR检出结果分析表明Kappa系数为0.88，表明二者具有良好的符合率。 3.AMDVVP2基因的遗传进化分析 本研究对dd-PCR检测到的来自山东不同地区、不同样品的部分阳性样本进行了基因测序，共获得17株AMDV的VP2基因序列，采用邻接法构建了系统发育树。遗传进化分析发现AMDV山东分离株VP2基因序列形成A、B、C三个分支，而来源于潍坊同一养殖场的环境样品W-SD11和W-SD12分别在A/C分支，表明不同基因型的AMDV可以共存于同一水貂养殖场。11株山东AMDV聚集在A和B分支中，与国外分离株（AMDV-FarEast株、AMDV-Utah株、AMDV-TR株）遗传关系密切，提示山东省内水貂源AMDV可能与水貂品种引进相关。C分支中4株山东AMDV（W-SD19、W-SD20、W-SD21、W-SD27）的VP2基因序列与吉林、大连等地水貂养殖场的AMDV基因遗传关系密切，而山东省水貂国内引种多来自于东北地区，进一步提示山东省水貂源AMDV与水貂引种密切相关。
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