摘要
目的： 本实验通过动物实验，观察中药复方益糖康对DR大鼠体重、血糖的影响，对视网膜组织结构和功能的病理改变的影响、对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路和NLRP3/ASC/pro-Caspase-1炎症小体通路关键蛋白表达的影响；通过细胞实验，观察中药复方益糖康含药血清对高糖诱导的HMEC-1细胞形态、活力和细胞中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路、NLRP3/ASC/pro-Caspase-1炎症小体通路关键蛋白表达的影响，分析中药复方益糖康改善DR的作用，并初步探讨其机制，旨在为中医药治疗糖尿病视网膜病变提供可靠的实验依据，为临床诊疗DR努力探寻新的治疗靶点。 材料与方法： 论文一：中药复方益糖康对DR大鼠视网膜及血-视网膜屏障系统的影响 SPF级雄性SD大鼠80只，适应性喂养后以体重为依据采用随机数字表法将大鼠分为正常对照组20只、高脂组60只。正常对照组大鼠予普食，高脂组大鼠予高脂饲料饲养。8周后，禁食12小时，采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）构建DM大鼠模型。成模后（随机血糖浓度≥16.7mmol/L）根据大鼠血糖水平将存活的大鼠随机分为模型对照组16只，益糖康组17只，西药组17只。利用大鼠与人等效剂量换算公式制备实验药物，造模成功后第2天开始灌胃。正常对照组和模型对照组予等体积0.9%生理盐水灌胃，益糖康组予9.45ml/kg/d益糖康煎剂灌胃、西药组予135mg/kg/d羟苯磺酸钙溶液灌胃，每日1次，连续12周。期间每3周测量体重和血糖，直到干预结束，处死取材。通过EB渗透实验、视网膜毛细血管超微结构、视网膜全层组织HE染色三个方面观察各组大鼠视网膜及血-视网膜屏障系统的病理改变，从而探讨中药复方益糖康对糖尿病DR大鼠视网膜及血-视网膜屏障的防治作用。 论文二：中药复方益糖康对DR大鼠视网膜TLR4/Myd88/NF-κB通路及其下游因子的影响 实验动物、药品及动物的饲养、分组、给药方法同论文一。运用western-blot法检测各组大鼠视网膜组织中TLR4、Myd88、NF-κB、NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白的表达水平，运用Elisa法检测血清中炎性因子IL-1β、IL-18的表达水平，运用免疫组化法检测大鼠视网膜组织中NF-κB、pro-Caspase-1蛋白的表达，运用免疫荧光法检测大鼠视网膜组织切片NLRP3、Caspase-1的表达，从而探讨中药复方益糖康治疗DR的可能机制。 论文三：中药复方益糖康对高糖诱导的视网膜内皮细胞的保护作用 SPF级雄性SD大鼠20只，采用随机数字表法将大鼠分为正常对照组10只、益糖康组10只。按照换算后实验动物给药量4倍浓度给予益糖康组大鼠进行灌胃；正常对照组按照20ml/kg的剂量进行生理盐水灌胃，并于末次给药后1h麻醉取血制备含药血清。HMEC-1细胞分为空白组、模型组、益糖康组、NF-κB抑制剂组、pro-Caspase-1抑制剂组共5组，予对应含药血清及抑制剂进行干预。应用倒置显微镜观察各组细胞形态变化、CCK-8法检测细胞活力、Western-blot法检测各组细胞中TLR4、Myd88、NF-κB、NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白的表达水平，Elisa法检测各组细胞上清液中IL-1β、IL-18的表达水平，免疫荧光法检测各组细胞NF-κB、pro-Caspase-1的表达，从而明确中药复方益糖康是否通TLR4/MyD88/NF-κB信号通路、NLRP3/ASC/pro-Caspase-1炎症小体通路发挥保护高糖诱导的HMEC-1细胞的作用。 结果： 论文一：中药复方益糖康对DR大鼠视网膜及血-视网膜屏障系统的影响 1.中药复方益糖康对DM大鼠体重、血糖均有维持稳态的功能，大鼠三多一少症状减轻。 2.DM造模前，与正常对照组相比，高脂组大鼠体重均显著增加（Plt;0.01）。造模后，应用药物干预的12周里，正常对照组大鼠体重整体依然呈逐渐增加趋势，而模型对照组、益糖康组、西药组大鼠体重整体均呈下降趋势。药物干预第3周，与模型对照组相比较，益糖康组大鼠体重明显增加，其下降趋势出现明显迟缓，差异有统计学意义（Plt;0.05）。干预第6、9、12周，模型对照组大鼠体重较益糖康组下降更为明显，而益糖康组大鼠体重下降趋势逐渐平稳，差异有显著统计学意义（Plt;0.01）。 3.DM造模后，未进行药物干预前，与正常对照组相比，模型对照组、益糖康组、西药组大鼠空腹血糖值显著升高（P＜0.01）；药物干预第3周，与模型对照组比较，益糖康组空腹血糖显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.01），干预第6、9、12周，益糖康组大鼠血糖下降趋势逐渐平稳。 4.与正常对照组相比，模型对照组、益糖康组、西药组标准化EB渗透量平均值均增多，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。益糖康组、西药组与模型对照组相比标准化EB渗透量平均值均出现明显减少的现象，差异具有显著统计学意义（P＜0.01、P＜0.01），但益糖康组与西药组组间比较无统计学差异（P＞0.05）。 5.通过大鼠视网膜组织HE染色结果发现，DR大鼠视网膜组织己经发生可见的病理变化，模型对照组大鼠视网膜组织内的神经节细胞减少、排列紊乱；内、外核层细胞排列紊乱；神经纤维层、节细胞层毛细血管扩张、管腔增粗，视网膜变薄，可见部分红细胞渗漏到血管外的组织中。与模型对照组相比，益糖康组视网膜各层结构病理改变较轻，细胞核排列较为规则，视网膜水肿较轻。 6.透射电镜结果显示模型对照组大鼠视网膜内皮细胞与正常对照组相比较出现了细胞肿胀、胞体呈指状突起、紧密连接减少、基底膜增厚、毛细血管壁断裂等明显的病理改变，而益糖康组与模型对照组相比病理改变明显减轻。 论文二：中药复方益糖康对DR大鼠视网膜TLR4/Myd88/NF-κB通路及其下游因子的影响 1.Western-blot检测结果：与正常对照组相比，模型对照组大鼠视网膜组织的TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1的蛋白表达水平显著增多（P＜0.01）；与模型对照组对比，益糖康组与西药组TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白水平显著降低（P＜0.01，P＜0.01），且益糖康组和西药组组组间无差异（Pgt;0.05）。 2.免疫组化法结果：分别标记DR大鼠视网膜组织切片上的NF-κB、pro-Caspase-1蛋白，观察阳性染色表达程度及分析反应显色强度的平均光密度值，结果提示与正常对照组相比，模型对照组大鼠视网膜切片上NF-κB、pro-Caspase-1蛋白均可见广泛的棕黄色表达，染色深，阳性染色表达增多，差异有显著统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）；与模型对照组大鼠比较，益糖康组和西药组染色相对较浅，阳性染色表达较少，差异有显著统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）。 3.免疫荧光检测结果：①各组视网膜切片上的NLRP3蛋白经过荧光染色后，与正常对照组相比，模型对照组大鼠视网膜切片可见广泛、明显的绿色荧光样表达，说明NLRP3表达明显增多，经过阳性细胞计数统计分析，差异具有显著统计学意义（Plt;0.01）。与模型对照组相比，益糖康组和西药组大鼠视网膜切片绿色荧光表达明显减少，NLRP3表达明显减少，经过阳性细胞计数统计分析，差异具有显著统计学意义（Plt;0.01）。②各组视网膜切片上的Caspase-1蛋白经过荧光染色后，与正常对照组相比，模型对照组大鼠视网膜切片可见广泛、明显的绿色荧光样表达，经过阳性细胞计数统计分析，具有显著统计学差异（Plt;0.01）。与模型对照组相比，益糖康组和西药组大鼠视网膜切片绿色荧光表达明显减少，经过阳性细胞计数统计分析，差异具有显著统计学差异（Plt;0.01）。 论文三：中药复方益糖康对高糖诱导的视网膜内皮细胞的保护作用 1.应用CCK-8方法检测HMEC-1细胞活性，结果提示与空白组相比，模型组、益糖康组细胞活性均显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，益糖康组细胞活性明显增高（P＜0.01）。 2.Western-blot法检测HMEC-1细胞中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达：结果提示与空白组相比较，模型组HMEC-1细胞中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达均显著增加（P＜0.01）；与模型组相比较，益糖康组显著降低了TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达（P＜0.01）。NF-κB抑制剂组与模型组比较，TLR4、MyD88蛋白表达均未见明显差异（P?0.05），NF-κB蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与益糖康组比较，TLR4、MyD88蛋白表达均明显增多（P＜0.01），NF-κB蛋白表达明显降低，具有显著统计学意义（P＜0.01）。pro-Caspase-1抑制剂组与空白组、模型组、益糖康组比较，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达均显著升高（P＜0.01）。 3.Western-blot法检测HMEC-1细胞中NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白的表达：结果提示与空白组比较，模型组HMEC-1细胞中NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达均显著增加（P＜0.01）；与模型组相比较，益糖康组显著降低了NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表达（P＜0.01）。NF-κB抑制剂组与模型组、益糖康组比较，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1表达均显著降低（P＜0.01），与益糖康组相比较，NF-κB抑制剂组对下游因子的抑制作用较益糖康组更为显著。pro-Caspase-1抑制剂组与模型组比较，NLRP3蛋白的表达无明显差异（P?0.05），而pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白的表达均显著降低（P＜0.01）；与益糖康组比较，pro-Caspase-1抑制剂组NLRP3蛋白表达量显著增多（P＜0.01），pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白的表达均显著降低（P＜0.01），pro-Caspase-1抑制剂对下游因子的抑制作用较益糖康组更为显著。 4.免疫荧光检测结果：①NF-κB：与正常组相比，模型组中NF-κB表达水平显著增多，呈广泛的红色荧光分布，差异具有显著统计学意义（Plt;0.01）。与模型组相比，益糖康组、NF-κB抑制剂组的NF-κB表达水平均下降，红色荧光分布减少，差异有统计学意义（Plt;0.01）。与益糖康组相比，NF-κB抑制剂组NF-κB表达水平下降更为显著，差异有显著统计学意义（Plt;0.01）。pro-Caspase-1抑制剂组对于其上游因子NF-κB抑制能力较低，与模型组相比未见统计学差异（P?0.05）。②pro-Caspase-1：与正常组相比，模型组中pro-Caspase-1表达水平显著增多，呈广泛的红色荧光分布，差异具有显著统计学意义（Plt;0.01）。与模型组相比，益糖康组、NF-κB抑制剂组、pro-Caspase-1抑制剂组的pro-Caspase-1表达水平均下降，红色荧光分布减少，差异有显著统计学意义（Plt;0.01）。与益糖康组相比，NF-κB抑制剂组、pro-Caspase-1抑制剂组的pro-Caspase-1表达水平下降更为显著，差异有显著统计学意义（Plt;0.01）。 结论： 1中药复方益糖康可以改善糖尿病视网膜病变大鼠视网膜屏障功能，降低血-视网膜屏障的损伤程度，延缓糖尿病视网膜病变大鼠视网膜组织的病理改变。 2中药复方益糖康可能通过抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号通路、NLRP3/ASC/pro-Caspase-1炎症小体通路的过度活化发挥抗炎、抗焦亡的作用。 3中药复方益糖康可能通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路、NLRP3/ASC/pro-Caspase-1炎症小体通路保护高糖诱导的HMEC-1细胞。 4NF-κB、pro-Caspase-1作为可能的靶点，对保护高糖诱导的HMEC-1细胞起到重要的调节作用。
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