摘要
随着世界人口的不断增长，粮食的供应就变得尤为重要。但是由于小麦、水稻、玉米、马铃薯等几种主要农作物长期受到病虫害的危害从而产量降低。根据联合国粮食及农业组织（FAO）的报告，全球范围内粮食作物减产17%-30%。许多研究人员一直关注生物防治作为植物病害可行替代品的潜力。生物防治是利用生物控制害虫，包括昆虫、螨虫、杂草和植物病害等，并借助于某些其他生物或其产品的技术。利用天敌减少害虫的发生是利用害虫管理途径实现环境安全和高效的重要因素。它是一种通过利用天敌减少或减轻害虫和害虫影响的环境有效手段。利用天敌、寄生昆虫和微生物（细菌、病毒和真菌）产生的药剂进行生物防治是一种重要的手段。微生物生物防治剂（MBCAs）是应用于植物病原生物防治的一种药剂，通过一系列的作用方式，这些微生物生物防治剂通过诱导植物免疫与植物发生相互作用，而与目标病原菌没有直接的相互作用。因此，这些新的解决方案在控制植物病害问题的同时最大限度地减少了对人类健康和环境的负面影响。 本研究的目的是对生物防治剂的培养条件和培养基组分进行优化。芽孢杆菌属是能够诱导植物产生抗性的微生物，具有广谱性，可抑制多种植物病原真菌。在内生细菌中，芽孢杆菌因其具有生防能力和促进植物生长的能力而备受关注。它们能够通过大量酶复合物的定向合成产生丰富的非核糖体肽，这些肽类具有模块化的结构组织，并有序地连接最终肽的氨基酸残基。该过程的产物是脂肽（lipopeptide）、因图林（inturin）和表面素（surfactin）。这些物质被用于生物表面活性剂在食品、环境管理、生物医学和化妆品领域的应用。它们已显示出作为主要免疫调节分子和抗粘附剂的潜力。它们也被用于基因转染，作为结合免疫球蛋白的配体。事实证明，通过抑制不同微生物的生物膜，它们在根除由不同微生物引起的医院感染方面是有用的，而且生物表面活性剂还可以用于生产绿色电力，因为生物表面活性剂可以增加比表面积并乳化油等疏水性化合物。本研究利用淀粉液化芽孢杆菌H1的生防潜力，研究了提高其生防活性的最佳培养条件和培养基组成，并与脂环化合物的产生有关。本研究的目的是寻找替代化学杀菌剂的可持续的生物防治方法，该菌株的细胞通常以长链的形式出现，不同于其他许多芽孢杆菌以单细胞的形式出现，具有良好的特性，可用于作物和提高植物的免疫力。 本研究的菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）H1，筛选自黑龙江省伊春市岱岭区森林土样。用光显微镜和革兰氏染色法观察其表型，发现H1菌株呈杆状，革兰氏阳性，H1菌株有生物防治效果。H1菌株和病原菌采用双培养法培养，在28℃的条件下培养5天，结果表明，H1菌株在植物病原菌菌丝体周围有明显的带，能表现出抗真菌物质的产生。为了探究种子液的最佳接种时间，绘制了H1菌株的生长曲线，发现最佳接种培养时间为8h。将种子接种于BPY培养基中观察抑制活性，发现当摇床转速为180rpm、温度为37℃，用离心分离机在4℃和15000rpm的转速下，离心25分钟提取H1菌株的上清液，经直径为0.22μm的滤膜过滤后，用该上清液进行抑菌活性最好。本研究中，分别将菌株H1与大豆根腐尖孢镰刀菌（Fusariumsolani）、马铃薯早疫病菌（AlternariasolaniSorauer）、小麦赤霉病菌（FusaHumgraminearum）、尖孢镰刀病菌（Fusariumoxysporum）、大豆菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum）、细链格孢（Alternariatenuissima）等6种造成农作物病害主要原因的病原微生物进行了抑菌圈对峙实验。37℃条件下培养5天后，在菌丝体周围有明显的抑菌斑，菌株H1表现出抑制活性，实验结果表明，菌株H1具有产抗真菌物质的能力。菌株H1对不同致病菌的抑制率分别为：大豆根腐尖孢镰刀菌（F.solani）23.56%，马铃薯早疫病菌（A.solaniSorauer）30.18%,，小麦赤霉病菌（F.graminearum）27.06%，尖孢镰刀菌（F.oxysporum）29.26%，大豆菌核病菌（S.sclerotiorum）26.97%，细链格孢（A.tenuissima）32.10% 为了提高解淀粉芽孢杆菌H1的生防能力，本研究通过替代碳源、氮源和无机盐，对发酵培养基的组成进行了改进，因为这些培养物质是抗生素生产的重要的介质组成部分。它们在反应中起着电子交换的作用。最佳培养基为BPY培养基。碳源是一种能源，与初级和次级代谢产物一样的产生，在生长过程中具有重要作用。碳源的代谢速率往往会影响生物量的形成和初级或次级代谢产物的产生，氮源对代谢产物的产生有着至关重要的影响。微生物可以利用无机盐和有机氮源，通过替换BPY培养基中碳源，比较不同碳源，如葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、可溶性淀粉、糊精和蔗糖对菌株H1的抑菌能力的影响，实验结果表明，甘露醇为唯一碳源时，菌株H1抑菌能力最强，抑菌率为32.85%；比较不同氮源，如蛋白胨、NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4H2PO4对菌株H1的抑菌能力的影响，结果表明当氯化铵(NH4Cl)为唯一氮源时，菌株H1对植物病原菌的抑制作用最强，为25.71%；NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl和LiCl为无机盐时，菌株H1都有明显的抑菌作用，其中以KCl抑菌效果最好，为30.23%。同事对影响菌株H1抑菌作用的培养基成分研究，采用单因素和正交试验的方法，确定了最佳培养基成分（g/L）：NH4Cl9g、KCl5g、甘露醇9g、酵母膏5g、牛肉膏5g和1000ml水，最终菌株H1对病原菌的抑制率提高了37.03%。 除了培养基组成的优化外，发酵条件也是影响次生代谢产物的因素，本研究继续对发酵条件进行优化。pH值对离子交换有影响，pH值影响所有大分子的结构。脂类在极碱性的pH下水解。细胞呼吸中产生ATP的质子动力取决于H+在细胞膜上的浓度梯度，温度是微生物生长的一个因素，因为在最适生长温度下生长速率最高。优化条件可以提高生物质产量。发酵条件包括接种量、发酵温度、发酵时间和培养基初始pH值。本研究通过对影响菌株H1发酵条件进行了优化。设置不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%、6%（v/v））在摇床中培养条件下：180rpm的摇床转速，37℃的培养温度，培养下48h，不同的初始pH（pH5、6、7、8、9）在摇床培养的条件下：37℃的培养温度，培养时间下48h,摇床转速为180rpm。不同培温度（25℃、28℃、31℃、34℃、37℃和40℃）在摇床培中培养条件是摇床转速为180rpm,培养下48h和研究不同发酵时间（12小时、24小时、36小时、48小时、60小时和72小时）对菌株H1的抑菌能力的影响，实验结果表明：最佳接种量为2%，抑菌率为47.89%；最佳初始pH为6，抑菌率为49.57%；最佳温度为28℃，抑菌率为49.86%；最佳发酵时间为36h，抑菌率为51.20%。因此，H1菌株发酵的最佳条件是；接种量的2%，初始pH6，28℃培养发酵36h，在此条件下，抑菌率达到48.48%。 产生次生代谢产物的H1菌株由于含有大量的次生化合物，且每种化合物在不同的条件下都能稳定存在，因此需要进一步研究其稳定性。由于脂肽具有离子基、羧基、氨基、硫醇基、咪唑基、酚羟基等活性基团，其活性与pH值有关。这些结构对其它底物具有亲和力，在pH值变化的环境中，根际的pH值总是会引起诱导性的变化。观察pH值对微生物分泌次生代谢产物的影响。通过调整条件研究抗生素的特性，研究抗生素的耐受性，这种能力对抗生素的适应使用具有重要意义。对菌株H1产生的次生代谢产物的稳定性进一步研究，将菌株H1的发酵上清液加入到PDA培养基混合，调节PDA固体培养基的pH值，分别至3、4、5、6、7、8、9、10和11，待平板凝固后，将病原菌分别接种于PDA混合固体培养基的平板中心，观察抑菌物质在不同pH条件下的稳定性及其抑菌能力。实验结果表明：pH值为5-8时抗菌活性最高，其他pH值范围抗菌活性仍在75%以上。研究了金属离子对抑菌活性的影响，用同种方法对抗菌物质影响的方法。结果表明，Ca2+能提高抗生素的活性，其抑菌率为41.82%，对照组为24.27%；Cu2+的抑菌率为30.02%；与对照相比Mg2+、Na+、K+对拮抗抗生素活性影响不大，K+对植物病原菌仍具有稳定性，抗真菌率为34.80%，而Na+对生防活性无影响。Mg2+的生防率为20.41%，与对照相比，影响很小。 相反地，Li+和Zn2+降低了H1菌株的抗菌活性，抑菌率分别只有11.89%和10.69%。从使用不同金属离子的角度研究了金属离子对抗菌活性的影响，发现某些金属离子会降低抗菌活性。
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