摘要
目的： 研究氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)自噬的影响及机制，探讨非酒精性脂肪性肝炎的发病机理。 方法： (1)体外培养HSC-T6细胞，剂量效应组用质量浓度(0、10、20、40、60μg/mL)的ox-LDL处理HSC-T6细胞24h；时间效应组用20μg/mL的ox-LDL处理HSC-T6细胞0、3、6、12、24h后，Westernblot检测自噬相关蛋白LC3II、Beclin1、p62的表达。 (2)不同质量浓度(0、10、20、40、60μg/mL)的ox-LDL处理HSC-T6细胞12h后，Westernblot检测通路相关蛋白Wnt5a、p-PKCδ、p-STAT3的表达。 (3)将HSC-T6细胞分为Control组、ox-LDL组、ox-LDL+si-NC组和ox-LDL+si-Wnt5a组。用Westernblot、qRT-PCR分别检测LC3II、Beclin1、p62、p-PKCδ、p-STAT3的表达；免疫荧光检测LC3II荧光亮点的表达；油红O染色观察HSC-T6细胞脂滴含量变化；消化法检测HSC-T6细胞培养液中羟脯氨酸(Hyp)的含量；ELISA检测细胞培养液中透明质酸(HA)和层粘连蛋白(LN)的含量。 (4)PKCδ抑制剂Rottlerin预处理细胞：将HSC-T6细胞分为Control组、ox-LDL组、ox-LDL+DMSO组和ox-LDL+Rottlerin组。Westernblot、qRT-PCR分别检测LC3II、Beclin1、p62、p-STAT3的表达；免疫荧光检测LC3II荧光亮点的表达；油红O染色观察HSC-T6细胞脂滴含量；消化法检测HSC-T6细胞培养液中羟脯氨酸(Hyp)的含量；ELISA检测细胞培养液中透明质酸(HA)和层粘连蛋白(LN)的含量。 结果: (1)经ox-LDL处理后HSC-T6细胞中LC3II、Beclin1蛋白含量增加，p62降解增多，且在ox-LDL质量浓度为20μg/mL作用12h达到峰值(Plt;0.05)。 (2)ox-LDL质量浓度为20μg/mL，作用12h时HSC-T6细胞Wnt5a、p-PKCδ、p-STAT3蛋白表达显著升高(Plt;0.01)。 (3)敲低Wnt5a后，自噬相关蛋白LC3II、Beclin1表达减少，p62降解减少，通路相关蛋白p-PKCδ、p-STAT3表达减少，细胞内LC3II荧光亮点减少，脂滴含量减少，细胞培养液中Hyp、HA、LN含量也减少(Plt;0.05)。 (4)抑制PKCδ后，LC3II、Beclin1表达减少，p62降解减少，通路相关蛋白p-STAT3表达减少，细胞内LC3II荧光亮点减少，脂滴含量减少，细胞培养液中Hyp、HA、LN含量也减少(Plt;0.05)。 结论: (1)ox-LDL可诱导HSC-T6细胞自噬。 (2)ox-LDL可促进HSC-T6细胞Wnt5a/PKCδ信号通路活化。 (3)ox-LDL可能通过增强Wnt5a/PKCδ通路诱导HSC-T6细胞自噬。
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