摘要
目的： 体外分离、培养BMSC植入骨质疏松性大鼠椎体内，小剂量、间断使用PTH促进BMSC向成骨细胞分化，初步研究移植BMSC治疗骨质疏松性椎体的可行性。 方法： 1.将42只大鼠随机分为空白对照组（SHAM,n=9）和模型组（OVX,n=33）。模型组采用切除双侧卵巢的方式来建立骨质疏松模型；对照组则切除卵巢周围相同体积大小的脂肪组织作为对照。模型建立10周后各组随机选取1只大鼠，脱颈法处死，取腰5椎体，骨组织常规经弱酸脱钙液脱钙、固定、石蜡包埋，组织切片HE染色，光镜下观察椎体骨小梁情况。 2.全骨髓贴壁法分离、培养大鼠原代BMSC，细胞传代过程注意观察各代细胞的形态学变化；流式细胞技术对BMSC进行鉴定。鉴定后的BMSC传代至P3代，光镜下观察选取生长状态良好融合度80%以上的BMSC接种于6孔板上，待细胞融合至90%，换用成骨诱导分化培养基进行成骨诱导，茜素红染色鉴定诱导结果。 3.对照组大鼠（SHAM,n=8）分为A组；骨质疏松组大鼠（OVX,n=32）随机分为模型组B组、PTH治疗组C组、BMSC组（D组）及联合治疗组E组，每组大鼠数量为n=8。A组和B组不作特殊处理，正常饲养;C组每隔一天皮下注入PTH（1-34），剂量为40μg/kg/day；D组和E组取大鼠腰部后正中切口，显露L3-L5椎骨，取P3代生长状态良好的细胞，调整细胞浓度为5×105cells/ml，采用1ml注射器经各椎体椎弓根近椎体处缓慢旋转进针植入BMSC,，植入剂量约为0.5ml。在植入BMSC的基础上，其中E组隔天皮下注入PTH（1-34），剂量同C组；D组则隔天皮下注入相同剂量生理盐水作为对照。干预8周后，ELISA法检测各组大鼠血清特异性碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）含量；处死各组大鼠，取L5椎体，标本经弱酸脱钙液脱钙、固定、石蜡包埋等常规步骤，组织切片HE染色，光镜下观察各组大鼠L5椎体骨小梁情况，评估BMSC的成骨作用。 结果： 1、去势手术10周后，造模组较假手术组L5椎体组织切片HE染色结果显示骨小梁排列较紊乱、稀疏，部分骨小梁出现断裂，表明大鼠骨质疏松模型建立成功。 2、全骨髓贴壁法体外分离、提取BMSC后，于恒温细胞培养箱中培养72小时，半量换液，光镜下即可看到部分贴壁细胞。此后每2天换液一次，原代细胞经过10天培养时间即可传代，此后每1W左右即可传代一次。取P3代细胞行流式细胞技术检测，结果：BMSC高表达CD29、CD44,不表达CD45，说明提取并代增的细胞为BMSC。P3代细胞行茜素红染色结果：光镜下可见BMSC逐渐向成骨细胞分化，并产生矿结节，细胞大片红染。 3、干预8周后，ELISA法检测结果：与模型组比较，PTH治疗组及联合治疗组血清特异性碱性磷酸酶（ALP）活性明显降低，差异具有统计学意义（Plt;0.05），而PTH治疗组与联合治疗组血清ALP活性则变化不大；与模型组比较，PTH治疗组与联合治疗组血清骨钙素含量明显升高（Plt;0.05）,而PTH治疗组与联合治疗组血清骨钙素则变化不明显（Pgt;0.05）；组织学切片则显示治疗组较模型组骨小梁较粗、排列整齐，髓腔较小，骨小梁密度较大。 结论： 仅通过移植BMSC作为干预手段，对治疗骨质疏松的作用并不显著，这可能与移植细胞的成活率、BMSC数量有关；BMSC在成骨诱导条件下，向成骨细胞分化能力增强，改善大鼠骨质疏松性椎体骨微结构，增强发挥治疗骨质疏松的作用。
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