摘要
肝纤维化是肝脏组织急性或慢性细胞损伤引起的可逆性伤口愈合反应，反映了肝脏修复和瘢痕形成之间的平衡[1]。目前肝脏慢性纤维化疾病的总负担不断增长，全世界每年约有200万人因此死亡[2,3]。然而，尽管对纤维化病理生理机制取得了实质性进展，但在确定抗纤维化靶点并转化为有效治疗方面仍为空白[3,4]，因此，减轻或逆转肝纤维化的研究具有直接的临床意义[5]。 肝星状细胞（hepaticstellatecells，HSCs）作为肝纤维化发病机制的主要调节因子，旁分泌或自分泌转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β），调控肝纤维化过程中胶原纤维等细胞外基质的合成、沉积、降解[4,6,7]。近期研究表明，TGF-β/SMAD信号通路中，SMADs需要与其它DNA结合转录因子相互作用，即β-catenin与T细胞因子（Tcellfactor，TCF）、叉形头转录因子O1（ForkheadboxO1，FOXO1）和乏氧诱导因子-1（hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1）相互作用，调控TGF-β/SMAD信号通路，其相对活性取决于结合β-catenin的“转录伴侣”[8]。当β-catenin与TCF结合时，促进细胞增殖和纤维化[9]，然而在与FOXO1结合后，发挥抗增殖、促凋亡、促进细胞在氧化应激下的存活[10,11]。在人类结肠癌细胞中发现FOXO1与TCF竞争结合β-catenin[12]，在肾脏纤维化的研究中发现[8]，β-catenin/FOXO1转录复合物形成可以促进TGF-β诱导的调节性T细胞（regulatoryTcells，Tregs）foxp3的表达[8,13]，发挥抗炎作用，然而β-catenin不同“转录伴侣”在HSCs及其肝脏纤维化中的作用仍不清楚。因此，本研究从细胞、动物、人体多水平，正向、反向多角度探讨TGF-β信号通路转录因子β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控HSCs增殖活化的作用机制，并在体内实验中探讨转录因子复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1对HSCs增殖活化、细胞外基质沉积、肝脏组织免疫调节的作用及其机制，发现转录因子复合物TCF、FOXO1竞争结合β-catenin，可以调节TGF-β促纤维化生物学效应开关，导致不同的生物事件结局，为精准靶向抑制肝脏纤维化的临床研究提供基础及思路。 目的： 1.结合细胞水平和动物水平实验，阐明肝脏纤维化过程中，TGF-β信号通路中β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录因子复合物在肝纤维化病程中的作用机制；研究通过调控HSCsβ-catenin转录因子复合物，启动TGF-β多重生物学效应开关，导向不同生物学事件结局的思路在改善肝脏纤维化中的应用。 2.在人体肝纤维化组织中分析β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与纤维化进展之间的关系，丰富肝纤维化疾病进展的病理生理基础，为肝纤维化的治疗提供了新的思路和策略，为进一步探索其在肝脏以及其它器官纤维化治疗中的临床应用提供支撑。 方法： 1.体外实验：人肝星状细胞LX2体外培养，分对照组、TGF-β诱导分化组、TGF-β诱导分化+ICG-001干预组、TGF-β诱导分化+ICG-001+AS1842856组通过WesternBlotting、RT-qPCR检测各组细胞外基质α-SMA和COL-I水平以及HSCs细胞周期、氧化应激功能，应用WesternBlotting、CoIP、PLA方法分析HSCs活化后，各组β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平变化。 2.体内实验：根据肝纤维化的不同病因，构建四氯化碳（CCl4）和胆总管结扎（BDL）两种肝纤维化小鼠模型，观察小鼠肝脏外观，速率法检测丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶，同时对肝纤维化不同时期进行肝脏组织切片、染色，提取RNA及逆转录、RT-qPCR，分析肝纤维化小鼠模型不同时期的纤维化以及炎症因子水平，判断不同模型的干预时间；采用邻位连接技术（PLA）分析肝纤维化不同时期β-catenin转录复合物变化规律。 3.在以上实验的基础上，对两种肝纤维化小鼠模型应用β-catenin/TCF抑制剂ICG-001进行干预，分别设立对照组、模型组、ICG-001干预组，观察小鼠肝脏外观，计算肝重、体重比，应用小鼠肝酶血清学水平检测、组织学染色、免疫组化、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原蛋白（COL-1）RNA表达水平检测相结合的方法，评价ICG-001干预后是否抑制小鼠肝脏纤维化，并应用ELISA方法检测了BDL各组肝脏组织炎症因子IL-10、IL-17、TNF-α、IL-6水平。 4.为正反两个角度进一步探索TGF-β信号通路转录因子复合物在抑制肝脏纤维化中的作用机制，BDL小鼠肝纤维化动物模型中增加TGF-β组、FOXO1抑制剂干预组，采用免疫组化、Westernblotting、RT-qPCR、CoIP、PLA实验，分析以β-catenin为核心的转录复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1之间的转换关系；应用组织免疫荧光共定位、组织HSCs特异细胞PLA实验分析体内TGF-β信号通路转录因子复合物对HSCs细胞的作用，并应用RT-qPCR检测了foxp3、TNF-α、P27kip1表达水平。 5.最后在胆道闭锁患者不同肝纤维化分期的肝脏组织中开展免疫组化、RT-qPCR、PLA实验，分析人体肝脏组织中TGF-β水平、细胞增殖水平、IL-10、β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与肝纤维化分期是否相关，为重新定向TGF-β信号通路转录因子复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF治疗肝纤维化的临床策略提供依据。 结果： 1.体外实验：β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1参与肝星状细胞的增殖活化 1.1β-catenin/TCF抑制剂ICG-001干预活化的LX2细胞，WB结果显示，ICG-001组LX2细胞α-SMA蛋白表达水平与TGF-β组相比显著下降；ICG-001+AS1842856组与ICG-001组比较，α-SMA蛋白表达水平显著高于ICG-001组；而ICG-001组与对照组相比，α-SMA蛋白表达水平差异不具有统计学意义，ICG-001+AS1842856组与TGF-β组相比，α-SMA表达水平差异不具有统计学意义。说明ICG-001可以抑制活化的HSCs转分化为肌成纤维细胞。 1.2MnSOD、p27kip1RT-qPCR结果显示，ICG-001组LX2细胞MnSOD、p27kip1表达水平的变化趋势与α-SMA、COL-IWB结果相反。说明ICG-001干预活化的HSCs使HSCs细胞周期阻滞，抗氧化应激水平增强。 1.3以β-catenin作为CoIP抗体的免疫共沉淀结果显示，ICG-001组与TGF-β组相比，β-catenin结合的TCF水平显著下降，FOXO1水平显著升高。 β-catenin、TCF、FOXO1PLA结果显示，ICG-001组LX2细胞β-catenin/TCF互作与TGF-β组相比显著下降，β-catenin/FOXO1结果与β-catenin/TCF相反。综合与β-catenin结合的TCF、FOXO1水平，应用TFratio（β-catenin/TCFversusβ-catenin/FOXO1）指标分析各组之间转录因子水平的差异，结果显示TFratio水平变化趋势与LX2细胞活化的特异性标记物α-SMA表达水平一致，LX2细胞的活化与TFratio水平升高密切相关。 以上结果说明β-catenin/TCF可以促进TGF-β诱导的HSCs增殖、活化。 2.体内实验；小鼠肝纤维化动物模型以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与肝纤维化病程关系初探 2.1CCl4肝纤维化小鼠模型在造模4w时，ALT、AST水平达到最高，随着造模时间延长，6w、8w时点ALT、AST水平呈现下降趋势；小鼠肝脏组织HE染色、网状纤维染色结果显示，在造模4w时纤维组织增生逐渐显著，网状纤维增粗、断裂，纤维间隔初步形成，随着造模时间延长，纤维间隔显著；小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示，随着CCl4注射时间延长至4w，α-SMA表达水平与对照组相比显著升高。小鼠肝脏组织IL-6、TNF-αmRNA表达水平在模型4w时达到高峰，foxp3表达水平在模型初期逐步增加，6w时达到高峰，8w时下降。 2.2BDL肝纤维化小鼠模型BDL术后1w，ALT、AST与Sham相比显著升高，术后2w时达到顶峰，术后3w、4w呈现下降趋势；小鼠肝组织HE染色、网状纤维染色、Masson染色、亮绿-天狼星红染色分别从炎症细胞浸润、网状纤维、胶原纤维增生不同维度检测结果显示，BDL术后1周可见毛细胆管增生，汇管区增大，肝细胞轻度水肿变性,少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，随着术后时间延长，可见局灶性坏死，毛细胆管数量增多，肝细胞空泡样变加重；小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示，BDL术后1w汇管区α-SMA表达水平与对照组相比显著增加，随着BDL术后胆总管结扎时间延长，α-SMA表达水平持续升高，。小鼠肝脏组织TNF-αmRNA表达水平在模型1w、2w、3w时逐步上升，foxp3表达水平在模型初期逐步增加，2w、3w时显著升高。 以上结果说明CCL4、BDL两种不同机制导致的小鼠肝纤维化模型分别在造模4w、1w时即出现炎症细胞浸润，纤维组织增生。 2.3CCL4、BDL模型不同时期对小鼠肝脏石蜡组织切片进行原位PLA实验，检测β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物在病程不同阶段的变化，结果显示β-catenin/TCF水平在CCl4造模4w时显著增高，β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平，在CCl4造模4w时显著下降；β-catenin/TCF水平在BDL手术造模1w时显著增高，β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平，术后1w时下降。 说明在两种模型中β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平与肝纤维化病程相关。 3.抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化 3.1CCl4、BDL肝纤维化小鼠模型分别应用ICG-001干预1w、2w，对肝脏外观、肝重/体重比、肝酶、组织学、α-SMA、COL-ImRNA及蛋白水平进行了比较，结果显示，CCl4、BDL模型中ICG-001干预1w时，肝重体重比较模型组无显著差异，干预2w时，肝重体重比与模型组相比显著下降。 两种模型1w、2w干预组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）与模型组相比均显著下降。 CCl4模型肝脏组织HE染色、网染结果显示，ICG-001组与同期CCL4模型组相比，炎性细胞浸润减少，纤维间隔包绕肝细胞团与同期模型组相比减少。BDL模型肝脏组织HE、Masson、网状纤维、天狼星红染色结果显示，ICG-001组与同期BDL模型组相比，毛细胆管增生及纤维化减少，炎性细胞浸润减轻，I型胶原、III型胶原数量显著降低，网状纤维断裂、肝细胞板增厚程度减轻；BDL模型天狼星红染色半定量结果显示，ICG-001组胶原沉积显著低于同期模型组。RT-qPCR结果显示两种模型ICG-001组2w时COL-I、α-SMA阳性比例与同期模型组相比显著下降。免疫组化结果显示CCl4模型ICG-001组COL-I水平显著低于同期模型组，干预2wCOL-I水平与干预1w时相比显著下降；BDL模型ICG-001组α-SMA水平显著低于同期模型组，干预2w时α-SMA水平与干预1w相比显著下降。 以上结果说明抑制β-catenin/TCF1w或2w，均可改善肝纤维化。 3.2CCl4、BDL模型在ICG-001干预后foxp3水平与模型组相比显著升高，p27kip1水平与模型组相比显著升高。 3.3BDL模型，ICG-001干预2w时，IL-6水平与同期模型组相比显著下降；TNF-α、IL-17变化趋势与IL-6一致，IL-10则显著增加。 4.BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控肝纤维化的分子机制 4.1BDL模型中，腹腔注射AS1842856抑制FOXO1后，免疫组化、WB检测小鼠肝脏组织α-SMA水平，结果显示，应用AS1842856干预后，α-SMA水平显著增加，肝脏纤维化加重；当在ICG-001基础上应用AS1842856干预时，α-SMA阳性细胞数与ICG-001组相比显著增加。α-SMA和COL-IWB及半定量分析结果显示：术后给予ICG-001，α-SMA和COL-I蛋白表达水平与BDL组相比显著下降，在此基础上应用AS1842856，α-SMA和COL-I蛋白表达水平与ICG-001组相比显著增加。 4.2各组小鼠肝脏组织核蛋白IP实验结果显示BDL组与Sham组相比，β-catenin/TCF升高、β-catenin/FOXO1降低，ICG-001干预后，与Sham组趋于一致，在此基础上应用AS1842856，β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与Sham组相比均显著下降。 各组小鼠肝脏组织石蜡切片进行PLA实验，结果显示各组TCF、FOXO1与β-catenin互作的变化趋势与肝脏核蛋白CoIP实验结果基本一致，BDL术后以及TGF-β的作用下，β-catenin、TCF互作呈现增长趋势，而β-catenin、FOXO1互作显示下降，与肝脏纤维化进展相关。ICG-001干预后β-catenin、TCF结合减弱，β-catenin、FOXO1结合增强，而在ICG-001+AS1842856组，β-catenin与TCF、FOXO1的互作关系均减弱，与肝脏核蛋白CoIP实验结果一致。 4.3组织免疫荧光结果显示BDL模型组HSCs增殖活化水平显著高于Sham组，ICG-001组显著低于模型组，TGF-β组HSCs数量及活化较BDL模型组增强，ICG-001干预TGF-β组HSCs增殖活化水平显著下降，与ICG-001组相比无显著差异。 BDL模型组HSCs细胞β-catenin/TCFligation与Sham组相比显著增加，ICG-001干预后与BDL组比较显著下降；TGF-β组β-catenin/TCF与BDL组相比显著增加，ICG-001干预TGF-β组，β-catenin/TCFligation较TGF-β组显著下降。β-catenin/FOXO1ligationBDL组显著低于Sham组，ICG-001干预后与BDL组比较显著升高；TGF-β组β-catenin/FOXO1与BDL组相比显著增加，ICG-001干预TGF-β组，β-catenin/FOXO1ligation较TGF-β组显著升高。 TFratio作为β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1的比值，可以综合评价与β-catenin竞争结合的TCF、FOXO1之间的动态变化，BDL模型组HSCs细胞中TFRatio与Sham组相比显著增加，ICG-001干预后与BDL组比较显著下降；TGF-β组与BDL组相比无显著差异，ICG-001干预TGF-β组，TFRatio较TGF-β组显著下降，与ICG-001组无差异。结合本部分2.1结果显示TFratio下降，肝纤维化程度减轻，反之则加重。 4.4BDL模型组小鼠肝脏组织RT-qPCR结果显示TNF-α、foxp3表达水平与Sham组比较显著升高，ICG-001干预后TNF-α显著下降，foxp3进一步增加，在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后，TNF-α水平显著升高，foxp3表达下降。 4.5ICG-001干预后p27kip1水平与BDL模型组相比显著升高，在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后，p27kip1水平发生显著下降。 5.人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物与纤维化进展的关系 5.1经过彩色多普勒超声初诊，腹腔镜胆囊插管造影确诊的16例胆道闭锁以及其它患者，依据HE、Masson、天狼星红染色结果进行纤维化程度的Ishak评分分期，其中0期3例，1期4例，2期、3期、4期各3例。 5.2不同分期患者肝脏组织Masson染色、IL-10、Ki67半定量分析结果显示，肝脏组织纤维化程度逐渐加重，IL-10水平S0-S2期显著升高，细胞增殖S2-S4期显著增强，这些指标均与TGF-β表达水平逐渐升高相关。 5.3患者肝脏组织石蜡切片PLA结果显示，S0、S1、S2、S3期β-catenin/TCFligationS0-S2期逐渐增多；β-catenin/FOXO1S0期最高，S0-S2期逐渐下降；TFratio与患者肝脏纤维化程度变化趋势一致。 结论： 1.体外人肝星状细胞LX2实验中，TCF、FOXO1竞争结合β-catenin，形成不同转录因子复合物，调控TGF-β诱导的LX2转分化及细胞周期、氧化应激水平。 2.体内动物实验中，TGF-β通路下游转录因子TCF、FOXO1同样存在竞争结合β-catenin；β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1作为TGF-β通路不同生物学效应的开关导致促纤维化和抗炎、细胞抑制--不同的生物学事件结局。体内通过调控HSCsTFratio，可以抑制HSCs细胞的增殖活化，减少细胞外基质沉积，同时调节肝脏组织免疫反应，减轻组织慢性损伤，改善肝纤维化。 3.β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1相对水平即TFRatio水平升高与BA患者肝脏纤维化病程早期进展相关。
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