摘要
烟草(Nicotiana tabacum)是我国广泛种植的经济作物之一，是喜温作物，对温度的变化很敏感。低温会导致烟苗生长缓慢，叶片狭长，叶片数减少，早花等现象的发生，从而降低烟叶产量和品质。MYB转录因子在植物中参与多种生理生化过程的调节，在抵御低温伤害等逆境环境中发挥着重要的作用。烟草基因组中有300多个MYB转录因子，但是关于它们功能的报道还较少。课题组前期研究发现一个R2R3-MYB转录因子NtMYB4a对低温胁迫有明显响应，为进一步探究该基因在低温胁迫下的功能及其调控机制，本研究构建了NtMYB4a的CRISPR/Cas9敲除载体，并通过农杆菌介导法导入到烟草植株中，成功获得突变植株。对突变株和野生型烟株进行低温胁迫处理，分析NtMYB4a和逆境响应基因的表达及植株的生理功能变化，初步解析NtMYB4a参与低温胁迫的生理分子机制，为烟草抗逆工程提供基因资源和突变体，为烟草抗低温特性改良提供科学依据。主要研究结果如下： (1)在NtMYB4a第1和第3外显子处选定两个靶标Y1和B1，构建CRISPR/Cas9编辑系统的双靶标敲除载体，通过农杆菌介导法导入烟草，获得119株转化材料。利用PCR法筛选出29株阳性植株，阳性率为24.37%。对29株阳性烟株的PCR产物进行测序，其中15株在靶点和非靶点处发生了不同程度的突变，突变率为51.72%。 (2)15个突变株共有4种突变类型。突变类型I有4株，在靶点和非靶点处分别发生碱基缺失、替换或插入，引起氨基酸的错义、同义或移码突变；突变类型II有1株，在靶点处发生碱基替换，造成同义和错义突变并产生终止密码子；突变类型III有1株，在靶点和非靶点发生碱基替换、插入和缺失，引起氨基酸的错义和移码突变；突变类型Ⅳ一共有9株，在靶点和非靶点发处发生碱基缺失和替换，引起氨基酸的移码突变和错义突变，并产生终止密码TAA，使蛋白质翻译提前终止。 (3)不同突变类型烟株的花、茎和叶中NtMYB4a表达量都下调，但NtMYB4a的下调表达量因类型和组织器官的不同而不同，NtMYB4a的表达量分别在突变株K10的花和中部叶、K17茎和K16上部叶中最低。突变烟株的株高都较野生型矮，花色较野生型变浅。进一步分析发现突变烟株中花青素含量都较野生型降低，花青素合成相关酶基因PAL、C4H、4CL、ANS、DFR的表达量都下调。成熟期突变株K17的叶色比野生型深，叶脉间出现了明显的皱褶，栅栏组织叶肉细胞含有较多的叶绿体。结果表明NtMYB4a参与烟草花青素的合成和烟株的生长发育。 (4)低温胁迫下，不同突变类型烟株的萎蔫程度较野生型烟株严重，脯氨酸含量较低，MDA含量较高，表明NtMYB4a的突变导致烟株抵抗低温的特性降低。低温胁迫下，突变株中PAL酶、木质素、花青素、SOD酶和MDA含量高于野生型，脯氨酸和CAT酶含量低于野生型。低温胁迫使野生型和突变株中NtMYB4a表达及木质素和花青素合成相关酶基因PAL、C4H、4CL、ANS、DFR、HCT表达都上调，但突变株中NtMYB4a、PAL、C4H、4CL、HCT的上调表达高于野生型。由此认为低温诱导NtMYB4a上调表达，并通过调控PAL、C4H、4CL、ANS、DFR、HCT的表达促进木质素和花青素的积累来抵御低温胁迫。 (5)低温胁迫下，NtMYB4a突变株K17和K16的脯氨酸、叶绿素、木质素、花青素含量、PAL酶活、SOD酶活、MDA及NtMYB4a、PAL、C4H、4CL、ANS、DFR、HCT的表达量都增加，但K17中的脯氨酸、叶绿素、木质素、花青素含量、POD、CAT酶活及PAL、ASN表达量均高于K16，而MDA及绿原酸含量和C4H、4CL、HCT表达量低于K16，表明不同突变类型的烟株在低温胁迫下所作出的生理反应不一致。
NETL