摘要
目的： 双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种典型的环境内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)，具有生殖毒性，尤其可导致男性生殖功能障碍，但其发病机制及治疗手段尚不明确。BPA造成的男性生殖障碍集中表现在降低雄激素水平和诱导细胞凋亡，而在男性生殖系统器官中，以睾丸的损伤最为严重。BPA不仅可以直接诱导雄激素受体（Androgen receptor，AR）发生磷酸化，也可以通过诱导Akt发生磷酸化，引起AR的Ser791/792位点磷酸化，最终导致细胞凋亡。课题组前期研究证实，BPA染毒和肾虚诱导的小鼠生精功能障碍在行为学、睾酮（Testosterone，T）和雌二醇（Estradiol，E2）水平、精子质量和数量、育仔率及睾丸差异蛋白等方面均有其相关性，因此，为了进一步探讨两者间的相关性以及补肾中药的治疗效果，本研究从BPA染毒和肾虚诱导的小鼠睾丸细胞凋亡、AR和Akt的磷酸化对BPA染毒和肾虚小鼠睾丸细胞凋亡中的作用、以及补肾中药提取物淫羊藿苷（Icariin，ICA）的保护作用及机制等三方面进行探讨，为中药防治EDCs导致的男性不育提供了可靠依据。 方法： 1.建立BPA染毒和肾虚动物模型，以及ICA药物干预模型。正常对照模型：腹腔注射生理盐水0.2ml/d，连续7d；低浓度BPA染毒模型：腹腔注射BPA溶液1mg/(kg?d)，连续7d；中浓度BPA染毒模型：腹腔注射BPA溶液10mg/(kg?d)，连续7d；高浓度BPA染毒模型：腹腔注射BPA溶液100mg/(kg?d)，连续7d；肾阳虚模型：腹腔注射氢化可的松注射液25mg/(kg?d)，连续10d；肾阴虚模型：腹腔注射氢化可的松注射液50mg/(kg?d)，连续7d。不同浓度ICA干预：造模后按50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg对小鼠进行灌胃治疗14d。 2.ELISA法检测1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg BPA染毒和肾虚模型及50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg ICA干预后小鼠血清T和E2水平变化； 3.HE染色观察不同浓度BPA染毒和肾虚模型小鼠睾丸组织损伤； 4.TUNEL染色观察不同浓度BPA染毒和肾虚模型，及50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg ICA干预后睾丸细胞凋亡的变化； 5.免疫组织化学染色观察不同浓度BPA染毒和肾阳虚模型小鼠睾丸AR、p-Akt的定位和表达； 6.免疫荧光染色观察不同浓度BPA染毒和肾阳虚模型小鼠睾丸组织p-AR定位和表达； 7.Westrern Blot观察AR、p-AR、Akt、p-Akt在BPA染毒和肾阳虚模型小鼠及50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg ICA干预后模型小鼠睾丸的蛋白表达。 结果： 1.BPA染毒浓度与小鼠血清中T水平呈负相关，与E2水平呈正相关；肾阳虚模型组与BPA模型无明显统计学差异（p＞0.05）。 2.BPA染毒模型小鼠睾丸组织结构出现不同程度损伤，表现为生精小管分布异常、间质细胞数量减少、生精小管基底膜不连续和生精细胞排列紊乱，且随BPA浓度增加，损伤明显增加。 3.10mg/kg、100mg/kg的BPA可以显著诱导小鼠睾丸细胞凋亡（p＜0.05），凋亡多发生在生精小管基底膜附近的生精细胞。两种肾虚模型也出现了不同程度的凋亡阳性信号，其中，与100mg/kg BPA染毒模型组相比，肾阳虚模型组小鼠细胞凋亡比例无统计学差异（p＞0.05），而肾阴虚组有显著差异（p＜0.05）。 4.BPA和肾虚均可造成睾丸组织中AR的表达显著下调（p＜0.05）；仅只有BPA染毒模型组和肾阳虚模型小鼠睾丸间质细胞出现p-Akt的阳性表达，且表达明显高于正常对照组（p＜0.05）。 5.BPA可以使AR发生磷酸化，其表达强度与BPA浓度呈正相关。p-AR表达于睾丸生精细胞，表达强度与肾阳虚组无统计学差异（p＞0.05）。 6.ICA可以上调BPA染毒和肾阳虚小鼠睾丸AR的表达，抑制p-AR与p-Akt介导的生精细胞凋亡，可以改善睾丸组织结构和血清激素表达（p＜0.05）；200mg/kg的ICA对生精细胞有促凋亡作用。 7.Western Blot结果显示：BPA染毒可降低小鼠睾丸AR蛋白的表达并上调p-AR和p-Akt的表达（p＜0.05）；BPA浓度与AR表达呈负相关趋势，与p-AR和p-Akt表达呈正相关趋势。肾虚模型小鼠睾丸也出现了AR的下调和p-AR、p-Akt的上调（p＜0.05）。而ICA干预后，可上调BPA染毒及肾阳虚小鼠睾丸AR的表达并降低p-AR、p-Akt的表达，100mg/kg的治疗效果最明显。各模型组和治疗组Akt表达无明显统计学差异（p＞0.05），上述蛋白表达量与形态学实验结果相同。 结论： 1.BPA可以干扰小鼠血清性激素表达水平，降低T浓度并升高E2浓度，随着BPA浓度的升高，其作用明显增加。另外，HE染色显示BPA可以损坏睾丸组织的正常结构、影响生精小管分布、减少间质细胞和生精细胞数量，对睾丸组织造成不可逆的损害。 2.10mg/kg和100mg/kg浓度的BPA可以显著诱导睾丸生精细胞凋亡，凋亡多发生在生精小管基底膜附近。BPA的细胞凋亡作用与肾阳虚模型存在相似性，与肾阴虚模型有差异。且BPA可以下调AR的表达，其诱导的生精细胞凋亡机制为AR及其激酶Akt的磷酸化。 3.100mg/kg腹腔注射7d所制备的BPA染毒模型出现明显的血清激素紊乱、睾丸组织损伤以及细胞凋亡。 4.肾阳虚与肾阴虚模型表型差异大，在与BPA模型比较过程中，发现肾阳虚模型与BPA模型在诱导睾丸细胞凋亡的机制上更为相关。这提示了BPA造成的男性不育可能属于肾阳虚范畴，两者间具体异同有待进一步研究。 5.ICA可以上调BPA染毒及肾阳虚模型小鼠睾丸AR水平，下调p-AR及p-Akt，对BPA和肾阳虚诱导的AR、Akt的磷酸化有抑制作用，可以改善睾丸组织结构、减少凋亡细胞比例并提升T表达量，对BPA染毒小鼠具有很好的保护作用。但高剂量的ICA（200mg/kg）反而会加重睾丸生精细胞的凋亡，机制有待进一步研究，目前经证实ICA治疗BPA染毒的最佳浓度为100mg/kg。
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