摘要
少弱精子症(Oligozoospermia and Asthenozoospermia，OAZS)主要表现为精子密度和精子活力的下降，约占男性不育的50％～75％，是引起男性不育的重要原因之一。各种因素如不良生活方式、精索静脉曲张、系统疾病、遗传变异、激素异常、环境污染等都会不同程度地影响男性的生殖功能，且它们之间常常共存，导致精液中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生和精浆中抗氧化能力之间的动态平衡失调，引起氧化应激损伤，降低精子质量水平。OAZS生殖系统内过多的氧自由基、高活性氧的状态可以看作是中医学“血瘀”证候的一种表现形式，而“肾虚”则是“血瘀”的重要病因，正如《医林改错》中记载:“元气即虚，必不能达于血管，血管无气必停留而为瘀”。因此贾金铭教授认为“肾虚血瘀”是导致OAZS的基本病机，并以补肾活血，填髓益精立法创制了补肾益精方(YJD)，临床应用多年，疗效确切，可显著提高精子密度、精子活力及正常形态率等。本研究采用网络药理学与数据挖掘技术分析YJD的潜在药理机制，并以环磷酰胺复制的OAZS小鼠模型和体外培养的Leydig细胞及Sertoli细胞为载体，以ROS-OS-p38MAPK-线粒体途径为研究主线，探讨YJD抑制氧化应激损伤，提高精子质量的作用及机制。 目的: 传承创新名老中医学术经验，采用网络药理学方法探讨YJD治疗OAZS的作用机制，并通过体内外实验明确YJD抑制氧化应激损伤和细胞凋亡的作用，从ROS-OS-p38MAPK信号途径深入探讨其作用机制。 方法: 1网络药理学分析:通过TCMSP、Swiss Target Preduction、Pharm Mapper、UniProt、CTD、Genecards、String、David等数据库;将YJD12种中草药采用MW≤500,AlogP≤10,Hdon≤5,HACC≤10,OB≥30％,DL≥0.18,CaCO-2≥-0.4七种仿制药原则筛选出这些成分中潜在的活性化合物及相对应的药物靶点，检索少弱精子症相关靶基因，两组交叉获取重合靶点，进行GO-BP及KEGG分析，从有效成分、潜在靶点、关键途径三个方面分析YJD治疗弱精子症的潜在药理机制。 2动物实验:以环磷酰胺复制少弱精子症小鼠模型，通过睾丸——生精小管——睾丸间质细胞/支持细胞——线粒体——凋亡相关分子等多层次进行研究;采用ELISA、HE染色、细胞计数、流式分析、透射电镜、Western blot等手段，检测睾丸指数，生精小管形态及超微结构，血清TT、FT、LH、FSH，雄激素生成及利用相关蛋白STAR、P450Scc、AR、ABP，睾丸/附睾组织ROS、MDA、SOD、GSH-Px，线粒体膜结构及功能，p38MAPK信号通路相关因子BAX、Bcl-2、Cyt-C、Caspase3等多纬度进行实验。 3细胞实验:分别以TM3细胞（体外培养）和Sertoli细胞（原代提取）为研究对象，并制备YJD含药血清进行干预;采用siRNA干扰技术敲减目标基因p38MAPK，PCR检测敲减p38MAPK效率，CCK8检测细胞增殖情况，western blot检测敲减p38MAPK后相关指标的变化，从睾酮的合成分泌与利用两个方面进行实验。 结果: 1通过筛选，YJD12味中药共获得75个有效成分，对应190个潜在靶点;检索少弱精子症靶点共1125个（含少精子症713个，弱精子症412个）;两组交叉获得重合靶点30个;对30个重合基因进行拓扑分析，共获得9个核心指标:MAPK1、AR、ESR1、AKT1、MAPK8、EGFR、MMP9、PTGS2和MAPK14。30个重合靶点富集分析主要涉及细胞对脂质、有机化合物、有毒物质、活性氧、类固醇激素的反应;细胞对激素刺激、氧化应激、外界刺激、炎症反应的反应;及生殖系统/结构调节等生物学过程;及MAPK信号通路、胰岛素信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路、P53信号通路、神经营养蛋白信号通路、T细胞受体信号转导途径、cAMP信号通路及FoxO、VEGF等信号通路。 2环磷酰胺建立少弱精子症模型小鼠的睾丸指数及体积减小(P＜0.05，P＜0.01);精子密度和活力下降(P＜0.01);血清TT、FT水平下降(P＜0.01)，血清FSH、LH水平增加(P＜0.01);睾丸及附睾组织中ROS、MDA含量明显增加(P＜0.01)，SOD、GSH-Px含量减少(P＜0.01);生精小管结构紊乱;线粒体结构和功能下降;p38MAPK、Caspase3、BAX、Cyt-C蛋白表达水平增加(P＜0.05，P＜0.01)，Bcl-2、STAR、P450scc、AR、ABP蛋白表达水平降低(P＜0.05，P＜0.01);给予YJD治疗后，OAZS模型小鼠睾丸指数无明显变化(P＞0.05)，睾丸体积增加(P＜0.01);精子密度和活力增加(P＜0.01);血清TT、FT水平增加(P＜0.01)，血清FSH、LH水平降低(P＜0.01);睾丸及附睾组织中ROS、MDA含量明显减少(P＜0.01)，SOD、GSH-Px含量增加(P＜0.01);生精小管结构及线粒体结构和功能改善;p38MAPK、Caspase3、BAX、Cyt-C蛋白表达水平降低(P＜0.05，P＜0.01)，Bcl-2、STAR、P450scc、ABP蛋白表达水平增加(P＜0.05，P＜0.01);AR蛋白水平无明显变化(P＞0.05)。 3在敲减TM3细胞中p38MAPK后，p38MAPK、Caspase3、Cyt-C、STAR及P450scc蛋白水平表达量均明显下调(P＜0.05)，BAX和Bcl-2蛋白相对表达量无明显变化(P＞0.05);以10％YJD含药血清干预细胞12h后，上述除Bcl-2上调外，其他指标蛋白表达水平再次出现明显下调(P＜0.01)。在敲减Sertoli细胞中p38MAPK后，p38MAPK、Caspase3、Cyt-C、BAX及AR蛋白水平表达量均明显下调(P＜0.05)，ABP及Bcl-2蛋白相对表达量无明显变化;以10％YJD含药血清干预细胞12h后，p38MAPK、Caspase3、Cyt-C及BAX蛋白水平表达量再次明显下调(P＜0.01)，Bcl-2蛋白相对表达量明显上调(P＜0.05)，AR及ABP蛋白相对表达量无明显变化(P＞0.05)。 结论: 补肾益精方(YJD)能够通过ROS/OS/p38MAPK-线粒体途径改善环磷酰胺制备少弱精子症(OAZS)小鼠模型，及Leydig细胞和Sertoli细胞模型的氧化应激(OS)损伤，改善线粒体结构及功能，从睾酮的分泌合成与利用等方面，促进精子发生和成熟，提高精子密度和活力，治疗少弱精子症。
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