摘要
类胡萝卜素是以异戊二烯为骨架的C40萜类化合物。在自然界中，类胡萝卜素主要存在于植物叶片、花和果实中，呈现红色、橙色和黄色。黄花甘蓝型油菜是由于花瓣中积累了大量的紫黄质和叶黄素，同时含有少量的新黄质、玉米黄质、β-隐黄质、β-胡萝卜素等。甘蓝型油菜C3染色体上的类胡萝卜素双加氧酶4基因（BnaC3CCD4）的突变使花色由野生型的白色突变为常见的黄色，同时它还包括其它三个CCD4拷贝（BnaA1CCD4、BnaA8CCD4和BnaC3CCD4）。其中BnaC3CCD4主要在花瓣中表达，其它的3个拷贝主要在叶片中表达。大量的研究表明，不同来源的CCD4基因对类胡萝卜素类型和氧化裂解双键的位置具有一定的特异性。尽管甘蓝型油菜的四个CCD4拷贝在表达部位上发生了明显的分化，但是在酶活功能上是否存在分化还未见报道，另外拟南芥CCD4（AtCCD4）和不同甘蓝型油菜CCD4（BnaCCD4）之间是否存在分化也未知。本文对拟南芥、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CCD4在基因组中的共线性以及它们核苷酸和氨基酸的序列进行了分析。进一步将BnaCCD4及AtCCD4在拟南芥ccd4突变体和黄花油菜甲9707中进行功能互补试验，来探究它们之间可能的酶活功能变异。主要研究结果如下： 1.甘蓝型油菜BnaCCD4基因的拷贝数与进化分析：由于芸薹属祖先种基因组的三倍化，同源CCD4基因组区域在芸薹属中具有三次重复。在随后二倍化形成白菜和甘蓝过程中，染色体的重排导致了白菜A3和甘蓝C7染色体上CCD4基因发生了丢失。最终，在白菜和甘蓝杂交形成的复合种甘蓝型油菜中出现了4个CCD4拷贝。进化树分析显示，四个BnaCCD4基因和来源于白菜的两个BraCCD4基因以及甘蓝的两个BolCCD4基因，构成了四个直系同源基因对。BnaA1CCD4、BnaC1CCD4、BraA1CCD4、BolC1CCD4分在了第一组，BnaA8CCD4、BnaC3CCD4、BraA8CCD4、BolC3CCD4分在了第二组。序列分析表明，分在第一组的两个BnaCCD4相似性为97%，分在第二组的两个BnaCCD4相似性也为97%。但是第一组和第二组的BnaCCD4相似性最高仅有88%。 2.甘蓝型油菜CCD4蛋白结构分析：对AtCCD4和4个BnaCCD4的氨基酸序列进行多重比较发现，它们在N端引导肽序列的保守性较差。对影响CCD4酶活的关键氨基酸位点进行分析，4个组氨酸，3个谷氨酸或天冬氨酸以及3个苯丙氨酸或异亮氨酸在它们的氨基酸序列中均保守，但相对位置发生了改变。利用SWISS-MODEL同源建模对它们的蛋白3D结构进行预测，表明它们均具有CCDs家族蛋白普遍存在的由β-折叠形成7个β-螺旋桨域和顶端由4个α-螺旋形成的α-螺旋域，这表明5个CCD4都具有裂解酶活性。但是在空间结构存在一定的差异。 3.AtCCD4和BnaCCD4基因互补拟南芥ccd4突变体分析：在衰老的拟南芥叶片中AtCCD4能使ccd4突变体的类胡萝卜素总量下降至野生型的水平，4个BnaCCD4使ccd4突变体的类胡萝卜素总量显著下降但未达到野生型水平，表明在衰老的拟南芥叶片中，AtCCD4在酶活上强于BnaCCD4。 在ccd4突变体的种子中AtCCD4、BnaC1CCD4、BnaC3CCD4和BnaA8CCD4均能使种子中类胡萝卜素总量以及其主要组分叶黄素和β-胡萝卜素下降至野生型水平，但是BnaA1CCD4不能使ccd4突变体种子中类胡萝卜素总量以及其主要组分叶黄素和β-胡萝卜素下降至野生型水平，表明在拟南芥种子中，BnaA1CCD4的酶活弱于其他几个CCD4。 4.AtCCD4和甘蓝型BnaCCD4在油菜花瓣中酶活的初步分析：用BnaC3CCD4花瓣特异性启动子在甘蓝型黄花品系甲9709中表达AtCCD4和4个BnaCCD4基因。观察转基因植株花瓣的颜色发现BnaA1CCD4和BnaC1CCD4只能使油菜花瓣的颜色由纯黄变为浅黄，而BnaA8CCD4、BnaC3CCD4以及AtCCD4均能使油菜花瓣的颜色由纯黄变为纯白。以上结果表明AtCCD4和不同BnaCCD4之间酶活存在差异。根据其在花瓣中差异的不同，可以将其分为两组，其中一组BnaA1CCD4和BnaC1CCD4酶活相似，BnaA1CCD4可能比BnaC1CCD4活性更弱；另外一组BnaA8CCD4、BnaC3CCD4和AtCCD4酶活相似。
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