摘要
目的： 食管癌是世界上最常见和最难治的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。中国是食管癌高发的国家之一，食管癌在中国90%为鳞癌，对放射线较敏感，故放疗成为目前我国食管癌主要、有效和安全的治疗手段，然而乏氧微环境介导起主导作用的食管癌细胞辐射抵抗已成为影响肿瘤放疗疗效的重要因素。目前关于LncRNA在食管癌乏氧微环境相关辐射抵抗中的作用及其机制尚未明确，本课题通过两组LncRNA表达芯片，将乏氧以及辐射抵抗结合，以筛选及验证在食管癌乏氧辐射抵抗过程中发挥关键作用的LncRNA。 方法： 1.利用梯度照射方法构建食管癌辐射抵抗细胞株：KYSE-150-R；利用乏氧培养诱导食管癌细胞株KYSE-150辐射抵抗。利用Arraystar LncRNA芯片分析辐射抵抗食管癌细胞株与其亲本细胞株间、乏氧培养细胞株与常氧培养细胞株之间的LncRNA差异表达谱，两组芯片取交集，通过文献检索结合生物信息学分析及qRT-PCR方法检测初步确定与食管癌乏氧辐射抵抗相关的特异性LncRNA（LINC01116）。 2.检测经乏氧处理后食管癌细胞株中LINC01116的表达变化，以明确乏氧对LINC01116的调控作用；通过包装慢病毒转染细胞，在食管癌细胞株中观察调控HIF-1α表达对LINC01116的影响，以明确乏氧是否通过HIF-1α调控LINC01116的表达。 3.以慢病毒为载体，通过包装慢病毒转染细胞，在食管癌细胞株中过表达或沉默LINC01116，通过克隆形成实验检测调控LINC01116后食管癌细胞在乏氧环境下辐射敏感性的改变，明确LINC01116对乏氧环境下食管癌辐射敏感性的调控作用；通过Western-blot检测食管癌细胞在乏氧培养条件下辐射诱导的DNA损伤及其修复的变化。 结果: 1.利用Arraystar LncRNA芯片分析辐射抵抗食管癌细胞株与其亲本细胞株间、乏氧培养细胞株与常氧培养细胞株之间的LncRNA差异表达谱，两组芯片取交集，通过文献检索结合生物信息学分析及qRT-PCR方法检测初步确定与食管癌乏氧辐射抵抗相关的特异性LncRNA（LINC01116）。 2.qRT-PCR检测显示乏氧环境下食管癌细胞株（KYSE-150、TE-1、Eca109）中LINC01116的表达明显升高；利用慢病毒转染技术沉默食管癌细胞中的HIF-1α，克隆形成实验显示沉默HIF-1α后食管癌细胞株在乏氧环境下的放射敏感性增加，并且qRT-PCR检测发现沉默HIF-1α后乏氧环境下的食管癌细胞株中LINC01116的表达下调。 3.Western-blot检测乏氧培养环境下食管癌细胞株（KYSE-150-H）受照射后不同时间点DNA损伤修复标记γ-h2ax的表达，结果显示沉默LINC01116后，γ-h2ax的表达升高，提示DNA损伤增加；过表达LINC01116后，γ-h2ax的表达降低，提示可以减少射线引起的乏氧食管癌细胞的DNA损伤，并加速细胞的修复。 结论： 本研究通过两组基因芯片筛选出并验证在食管癌细胞乏氧微辐射抵抗中发挥关键作用的LncRNA：LINC01116。本研究从LncRNA这个新的视野为阐明食管癌辐射抵抗相关机制提供新依据与新思路，为临床上克服食管癌辐射抵抗提供了新的契机。
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