摘要
研究表明，羽绒来源于毛囊，而禽（鸟）类毛囊周期性循环的调控与羽绒性状发生发育息息相关。毛囊的发生发育及循环受极为复杂的信号调控网络调控，目前对于毛囊的研究多集中于小鼠、山羊和鸡上，对于有较高绒用经济价值的鹅的研究较少。羽绒性状是鹅育种工作中重要的经济性状和遗传改良目标。鹅羽绒的产量及品质受品种、饲养周期及季节等因素影响差异较大。然而，关于鹅羽绒性状产量与品质提升方面的育种研究工作突破甚微，传统的育种方式遗传进展表现缓慢，而如果从分子、细胞水平探析并掌握鹅毛囊周期性循环的调控机制，将有助于加快鹅羽绒性状分子育种工作的进展，为鹅业育种带来新希望。BMP/Smad通路是已知的毛囊发生发育过程中重要的调控通路之一，然而其在家禽胚胎期皮肤毛囊发生发育过程中的调控机制尚未明晰。本研究聚焦BMP/Smad通路在家禽胚胎期皮肤毛囊发育过程中潜在的调控机制，通过BMP/Smad通路基因在胚胎期背部皮肤毛囊表达规律研究结合体外调控通路的激活与抑制对细胞增殖和凋亡的影响以期对BMP/Smad通路在家禽皮肤毛囊发育过程中的作用和调控机制进行初步探究。研究内容和结果如下： 本研究以豁眼鹅、“京白1号”鸡为研究对象，在团队前期研究基础上选取胚胎期三个时间点取样：初级毛囊原始发生期（鹅胚胎期第13天/E13；鸡胚胎期第9天/E9）、次级毛囊发生期（鹅胚胎期第18天/E18；鸡胚胎期第12天/E12）、次级毛囊发育较大时期（鹅胚胎期第28天/E28；鸡胚胎期第18天/E18），通过甲基绿-派罗宁染色、酸性固绿-苏木素染色、Pollak染色以及Goldner染色对鹅和鸡胚胎期皮肤毛囊发育及和胶原纤维分布进行染色观察，而后借助实时荧光定量PCR和Western Blotting对BMP/Smad通路相关基因和蛋白尤其是SMAD1的磷酸化水平进行研究。结果表明随着胚胎的发育，鹅胚和鸡胚背部皮肤逐渐增厚，且各时间点皮肤厚度之间有显著差异（P＜0.05），胶原纤维在胚胎发育中期（鹅E18、鸡E12）后开始出现，至胚胎发育后期胶原纤维几乎遍布整个真皮层。BMP/Smad通路受体蛋白BMPR1A、BMPR2及P-Smad1水平在三时间点呈现下调趋势，即BMP/Smad通路活性逐渐降低，且胚胎后期显著低于前期和中期（P＜0.05）。 为了进一步揭示BMP/Smad通路对皮肤毛囊发育的潜在调控作用，本研究提取了培养至第15天的鹅胚真皮成纤维细胞，设置0μmol/L、低浓度（0.2μmol/L）、中浓度（2μmol/L）、高浓度（20μmol/L）激活剂SJ000291942和抑制剂DMH1添加组，通过CCK8法判断通路调控对细胞活力的影响，BrdU标记增殖细胞，流式细胞术检测结合实时荧光定量PCR和Western Blotting对增殖凋亡和凋亡通路相关基因和蛋白进行研究。结果表明，中高浓度DMH1可以显著降低细胞活力（P＜0.05）。BMP/Smad通路的变化对细胞增殖亦有影响，其蛋白表达结果显示P-Smad1正调控PCNA的蛋白表达（R2=0.57675，P＜0.05）。BMP/Smad通路也参与到细胞凋亡的调控过程中，其中，低浓度与高浓度SJ000291942细胞凋亡率降低（P＜0.05），中浓度SJ000291942细胞凋亡率升高（P＜0.05），而中高浓度的DMH1细胞凋亡率显著上升（P＜0.05），P-Smad1与早期凋亡细胞率和晚期凋亡细胞率均呈负相关（早期R2=-0.6875993，晚期R2=-0.5532244，P＜0.05），其蛋白表达结果显示BCL2蛋白表达量呈P-Smad1含量变化的负相关关系（R2=-0.8739813，P＜0.05），Bax的表达亦与P-Smad1的变化（R2=-0.5352823，P＜0.05），BCL2/Bax表现出相似的负相关性（R2=-0.7917466，P＜0.05），Caspase-3蛋白表达量与P-Samd1无相关性（R2=-0.1958351，P＞0.05）。 综上所述，本研究表明鹅和鸡胚胎期背部皮肤有着相似的发育规律，BMP/Smad通路基因和蛋白在鹅和鸡胚胎期背部皮肤发育的过程中均有表达并伴随胚胎的发育通路活性逐渐降低，BMP/Smad可能参与到胚胎早期背部皮肤细胞的增殖分化和胶原纤维的形成以及毛囊的增殖分化调控中。BMP/Smad通路P-Smad1的活性水平可以影响成纤维细胞的增殖与凋亡状态，其可正面调控细胞增殖并借助转录因子磷酸化水平的变化调控细胞凋亡。结合以上结论推测BMP/Smad对胚胎期皮肤毛囊的影响可能的机制之一是通过对真皮层成纤维细胞增殖和凋亡的调控影响毛囊所处的微环境，进而调控毛囊的发育。
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