摘要
洛克沙胂(Roxarsone，Rox)是一种有机砷化合物，具有抗球虫、促进动物生长等作用，目前仍在许多发展中国家作为饲料添加剂使用。洛克沙胂吸收率较低，大多随粪便排出体外，可通过环境及动物性食品途径增加人砷暴露的风险。现有研究发现Rox在体内体外具有促进血管生成的作用。本实验室前期研究表明Rox可通过血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)信号，促进血管或肿瘤血管生长。本文拟通过体外血管内皮细胞培养，体内基质胶塞模型及小鼠B16细胞移植瘤模型，采用特异性信号抑制剂或RNA干扰技术，研究VEGFR2/mTOR/S6K1信号在洛克沙胂促血管生成中的作用，为Rox促血管生成的作用机制研究积累资料。 在大鼠血管内皮细胞体外培养中，不同处理分组如下:对照组(PBS)、0.1μmol/L、1.0μmol/L和10.0μmol/L Rox处理组、雷帕霉素处理组（25nmol/L）、Rox+雷帕霉素共处理组(1.0μmol/L+25nmol/L)、SU5416处理组（0.2μmol/L）、Rox+SU5416处理组（1.0μmol/L+0.2μmol/L）、10ng/mL VEGF阳性组、VEGF+SU5416共处理组。采用MTT法检测细胞活性、EdU法检测细胞增殖、划痕试验检测细胞迁移能力、管形成试验检测血管样结构的生成，Western Blot及荧光定量PCR检测细胞中VEGFR、mTOR/S6K1等相关蛋白的表达。结果表明1.0μmol/L Rox能够显著提高血管内皮细胞的活性、增殖、迁移和管形成能力，上调mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、VEGF和VEGFR2蛋白表达，显著提高mTOR和S6K1mRNA表达。雷帕霉素能够显著抑制Rox对内皮细胞的活性、增殖、迁移和管形成的促进作用，显著降低p-mTOR、p-S6K1和VEGF蛋白表达。SU5416能够降低Rox对内皮细胞的增殖、迁移和管形成的能力的促进作用，显著降低Rox对细胞中p-mTOR和p-S6K1蛋白表达的促进作用。 在小鼠B16移植瘤模型研究中，小鼠腋下注射B16黒色素瘤细胞构建移植瘤模型。见瘤后荷瘤鼠不同处理分组如下:对照组(PBS)、25mg/kg Rox灌胃处理组、SU5416注射处理组(10mg/kg)、Rox+SU5416共处理组（25mg/kg+10mg/kg）。试验期间测量小鼠体重、肿瘤体积。至注射B16细胞14d后，剥离肿瘤并称重;肿瘤切片进行HE染色和CD34免疫组化分析，并检测肿瘤组织中mTOR/S6K1通路相关蛋白表达。结果表明Rox处理组肿瘤的体积和重量，及肿瘤组织中血管生成显著增加;mTOR、S6K1及其磷酸化蛋白，以及VEGF的蛋白水平和mRNA水平均显著上调。VEGFR2拮抗剂SU5416能够显著降低Rox对肿瘤生长和瘤内血管生成的促进作用。 在小鼠基质胶塞模型研究中，利用已经建立的靶向重组慢病毒RNA干扰大鼠血管内皮细胞中VEGFR2的表达。将不同处理后的血管内皮细胞注入小鼠皮下，形成胶塞，检测基质胶塞的体积和重量;HE染色和CD34免疫组化分析胶塞中血管的生成。血管内皮细胞的不同处理如下:对照组(PBS)、1.0μmol/L Rox处理组、RNAi干扰组、Rox+RNAi共处理组、NC组。结果表明，Rox显著增加胶塞的体积和重量，促进基质胶中血管的生成。SU5416能够显著降低Rox对基质胶塞中血管生成的促进作用。 综上所述，Rox在体外能够促进大鼠血管内皮细胞的生长、迁移和管样结构的形成;抑制VEGFR2或mTOR信号，能够显著抑制Rox对内皮细胞生长的促进作用。Rox在体内能够促进移植瘤和基质胶塞的生长及其血管生成，抑制VEGFR2能够显著降低Rox对肿瘤生长的促进作用;靶向VEGFR2RNA干扰，能够抑制Rox对基质胶塞中血管生成的促进作用。VEGFR2/mTOR/S6K1通路在Rox体内体外促血管生成中发挥着重要的调节作用。
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