摘要
作为稻谷优势霉菌之一的黄曲霉（Aspergillusflavus,A.flavus）会潜伏在健康粮粒表面，引起稻谷霉变并影响粮食质量。我国稻谷普遍受A.flavus产生的黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）污染，A.flavus已严重威胁食品安全和人体健康，制约我国稻谷产业的健康发展和人们美好生活需求。现阶段关于粮食霉菌污染的研究主要集中在收获后脱毒方面，针对病原菌对稻谷的侵染过程及机制的研究较少。本课题通过对稻谷在被A.flavus侵染过程中的表观观察、霉菌总数、AFB1含量、A.flavus的转录组学、理化指标和代谢组学分析等多个层面研究A.flavus侵染稻谷的过程和分子机制，为粮食采后污染防控与绿色保鲜技术提供理论依据。主要研究成果如下： （1）以在PDA培养基上生长的A.flavus为空白，比较A.flavus侵染稻谷时A.flavus在稻谷上的形态变化，结合对稻谷表观、霉菌量和AFB1含量的影响，得到A.flavus对稻谷的侵染规律，探索出A.flavus在稻谷体内外的生长过程，确定侵染时期和关键时间点。结果发现A.flavus在适宜条件下（稻谷水分为27.5±0.5%（干基），温度29±1℃，湿度85±1%，黑暗）可被激活，开始侵染，3d内预先以稻壳为营养基质，萌发在表面形成分支菌丝体，并于第3d开始霉变、产毒；自第3d后，4、5、6、7d A.flavus对稻壳表面侵染逐天加剧，第7d严重霉变、产毒最高，同时对稻谷色度产生影响。所以选择前3d为侵染前期，后4d为侵染后期，并将第3d作为侵染关键点。部分稻壳上长出的菌丝体以两种方式对稻谷内部进行侵染：一是直接穿透侵染，二是难以突破稻谷外壳时，从伤口处获得其生长必须的营养物质，从稻谷开口缝隙处侵染。 （2）以在PDA培养基上的A.flavus为空白，对前期（接种后3d）和后期阶段（接种后7d）稻谷上的A.flavus进行了高通量转录组测序，通过生物信息学分析了A.flavus侵染前后的差异表达基因及其相关代谢途径。结合在侵染过程中A.flavus的蛋白含量、ATP浓度、离子ATP酶活等理化变化，为转录组数据及结论提供验证。发现在PDA上培养3d与在稻谷上培养3d的A.flavus共有5283个差异表达基因，其中3313个基因上调，1970个基因下调；培养7d的A.flavus之间共有5074个差异表达基因，其中2553个基因上调，2474个基因下调；关键差异表达基因主要涉及细胞壁降解酶分泌、氨基酸代谢、能量调控和毒素代谢等方面。 （3）运用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术，检测侵染稻谷的A.flavus的代谢产物，结合多元统计变量分析筛选出差异表达代谢物，研究A.flavus在侵染稻谷过程中代谢物的变化及相关主要代谢通路。通过PCA、OPLS-DA等样品的代谢谱进行分析，筛选出符合条件的显著差异代谢物有537种；对各组火山图进行分析，得到前期差异表达代谢物共有65个，其中45个上调，20个下调；后期差异表达代谢物共有138个，其中132个上调，6个下调；关键差异代谢物主要涉及氨基酸代谢、脂肪酸生物合成、次生代谢物合成等通路。 基于上述研究，可发现A.flavus在接触稻谷后，能够迅速激活并开始定殖。侵染过程被分为前期（稻谷上孢子产生、开始霉变产毒，A.flavus完成宿主表面的侵染）和后期（稻谷的霉变严重、产毒加剧，A.flavus完成对宿主内部的侵染）。具体过程与机制如下：在前期，侵染稻谷的A.flavus首先降解稻谷表面纤维素等多糖，因creA的下调表达，促进纤维素酶表达，使细胞快速利用多糖物质。代谢物油酸被作为A.flavus营养碳源和能源而利用，促进霉菌侵染稻谷表面。此时，在稻谷组织生长的A.flavus乙酸酯单元进入毒素合成途径被抑制，但aflH、hypD和hypB基因显著上调刺激毒素合成，开始产生毒素，以完成前期侵染（对稻谷表面的侵染）过程。到后期，代谢物乙酰基-N-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸产生，A.flavus受到稻谷（宿主）防御机制影响。因部分产毒调控基因刺激毒素等次生代谢物合成，尤其是aflS基因的上调在后期加快了毒素合成速率，最终引起A.flavus在稻谷中的产毒量比培养基中高，以完成对稻谷的内部侵染。同时，参与氨基酸代谢的维生素B6、丙氨酸与参与能量代谢的半乳糖-1-磷酸等物质的上调保障了乙酰辅酶A的产生和A.flavus侵染稻谷组织的能量供给。与甘油酯代谢途径有关基因显著上调，代谢物中参与脂肪酸生物合成的硬脂酸表达上调，保障甘油的生成和脂肪酸正常供给，确保甘油酯和脂肪酸对维系和调节细胞的正常生物学功能起重要作用，保障A.flavus机体功能完整性，促进A.flavus对稻谷的持续侵染。
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