摘要
目的： DEHP具有明确的生殖毒性，对能量稳态的影响也被逐步证实。孕期暴露DEHP对子代雌鼠下丘脑的影响，国内少有研究报道。本研究利用转录组测序技术探究孕期DEHP暴露对大鼠子代雌鼠下丘脑LncRNA表达的影响，通过比较染毒组与对照组下丘脑差异表达的LncRNA和mRNA，分析并预测DEHP影响下丘脑-垂体-性腺轴与能量代谢的机制。 方法： 1.动物饲养与样品采集：选择60日龄SPF级SD大鼠，受孕后分为染毒组与对照组。自孕0～18d（G0～G18）连续灌胃染毒，子代雌鼠出生当天取下丘脑组织-80℃冰箱保存至检测。 2.分别取3只染毒组、对照组子代大鼠下丘脑组织，混合样品并提取总RNA，构建RNA文库，使用illumina Hiseq测序平台进行测序。 3.获得reads进行转录本组装，得到mRNA与LncRNA转录本，利用DESeq软件分析，筛选出差异表达的mRNA和LncRNA，继而预测差异表达LncRNA的靶基因，并对差异LncRNA的靶基因和mRNA作GO与KEGG富集分析。 4.将筛选出差异性表达显著的目的LncRNA通过关联性分析（pearson相关系数≥0.9），获得LncRNA-mRNA关系对，共表达的mRNA行GO与KEGG富集分析，预测目的LncRNA的功能及可能参与的生物过程。 5.利用实时荧光定量PCR检测技术验证在染毒组与对照组的下丘脑细胞中差异表达的目的LncRNA所展现的趋势与测序结果一致。 结果： 1.通过RNA-seq测序，所得原始数据结果显示：染毒组与对照组子代大鼠下丘脑的RNA分别得到393142752和388608118条reads；染毒组及对照组分别有376311164（95.57%）和373196206（95.70%）条reads与大鼠基因组相匹配。 2.利用DESeq软件，以|log2FC|＞=1和Pvalue＜=0.05为条件，筛选两组之间的差异转录本，筛查到108条显著差异的LncRNA，其中60条表达上调，48条表达下调，5954条无明显变化；筛查到342条显著差异表达的mRNA，其中196条表达上调，146条表达下调，29478条表达无明显变化。 3.对差异表达的mRNA和LncRNA进行GO与KEGG富集分析，mRNA的GO分析显示主要参与大脑发育、激素合成分解代谢过程等方面；KEGG分析显示：谷氨酸能突触、PPAR信号通路、加压素调节的水吸收等显著富集。LncRNA的GO分析显示激素生物合成过程、脂质代谢的调控等方面；KEGG分析显示：雌激素信号通路、Ras信号通路信号转导、PI3K-Akt信号通路等显著富集。 4.将目的LncRNA与差异表达的mRNA进行共表达分析，以r≥0.90且p＜0.05为筛选条件，共筛选出15条mRNA与ENSRNOT00000047544具有相同表达模式；共筛选出7条mRNA与MSTRG.6385.1具有相同表达模式。将共表达的mRNA进行GO和KEGG富集分析，显示与PPAR信号通路的有关。 5.qPCR结果表明：ENSRNOT00000047544及MSTRG.6385.1在染毒组子代大鼠雌鼠下丘脑组织中表达高于对照组，和RNA-seq测序结果一致。 结论： 1.孕期DEHP染毒组与对照组相比，F1代大鼠雌鼠下丘脑组织存在LncRNA及mRNA的差异表达。 2.差异表达的LncRNA和mRNA功能分析结果显示产前DEHP暴露可能对子代雌鼠下丘脑的性腺激素和能量代谢过程有影响。 3.通过共表达分析筛选出LncRNA ENSRNOT00000047544及LncRNA MSTRG.6385.1可能参与能量代谢调控。
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