摘要
目的: 本研究旨在探讨锌指蛋白ZNF276(Zinc finger protein276)在乳腺癌中的生物学功能及分子机制，阐明其作为转录因子在乳腺癌发生发展中的作用及意义。 方法: 1.利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库结合组织芯片分析ZNF276在乳腺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平，明确ZNF276与乳腺癌患者临床病理特征的相关性;利用RT-qPCR和Western blot分析ZNF276在多种乳腺癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平; 2.使用两种乳腺癌细胞分别进行ZNF276过表达/敲低，通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell细胞迁移、侵袭实验以及伤口愈合实验评估过表达/敲低ZNF276对乳腺癌细胞体外增殖、侵袭和迁移的影响，通过裸鼠成瘤实验检测ZNF276对乳腺肿瘤体内生长的影响; 3.通过转录组测序联合CUT Tag(Cleavage under targets&tagmentaion)实验探究ZNF276的潜在下游靶基因，利用双荧光素酶报告基因实验验证ZNF276对靶基因启动子的转录调控关系，通过构建截断序列表达质粒明确ZNF276与靶基因启动子的功能结合域; 4.通过TOP/FOP Flash实验、免疫荧光、RT-qPCR和Western blot等方法探索ZNF276调控的相关通路，进一步证明ZNF276是否通过调控靶基因影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移; 5.通过RT-qPCR和Western blot分析乳腺癌细胞内ZNF276与靶基因及通路相关基因之间的mRNA和蛋白表达相关性; 6.利用免疫沉淀联合质谱（immunoprecipitation-mass spectrometry，IP-MS）筛选ZNF276潜在的互作蛋白，并通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，coIP）确定ZNF276的结合蛋白，TOP/FOP Flash实验和双荧光素酶报告基因实验探究ZNF276是否通过招募互作蛋白来调控靶基因转录及表达。 结果: 1.TCGA数据库结果显示，ZNF276在乳腺癌组织中mRNA表达较癌旁组织下调 2.(P＜0.01)，低表达ZNF276与乳腺癌患者预后不良呈正相关;免疫组化结果表明，ZNF276在乳腺癌组织中的蛋白表达量高于癌旁组织(P＜0.05)，且ZNF276蛋白表达水平与乳腺癌患者年龄、WHO分级、TNM分期、临床分级、ER水平等临床病理特征显著相关(P＜0.05);ZNF276在MDA-MB-231、MCF-7、BT-474和UACC-812乳腺癌细胞系中的mRNA及蛋白表达水平均高于正常乳腺细胞(P＜0.05或P＜0.01)，而在SK-BR-3细胞系中表达下调(P＜0.001); 3.过表达ZNF276后，MDA-MB-231细胞体外增殖、迁移和侵袭能力显著增强，而敲低ZNF276抑制MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.01或P＜0.001);与对照组相比，注射ZNF276过表达细胞株的实验组小鼠瘤体显著增大且增长速度更快(P＜0.05或P＜0.001); 4.转录组测序共筛选出4173个差异表达基因(2194个上调基因，1979个下调基因)，CUT Tag共检测出4432个基因，二者包含379个共同基因;从中筛选出15个差异倍数较高的基因进行RT-qPCR验证，结合文献报道推断细胞色素P4501B1(Cytochrome P4501B1，CYP1B1)为ZNF276的潜在靶基因;双荧光素酶报告基因实验证实CYP1B1为ZNF276作用于乳腺癌细胞的下游靶基因，且ZNF276通过C2H2结构域与CYP1B1启动子的-1127bp至-921bp区域结合并激活转录; 5.ZNF276可上调CYP1B1的mRNA及蛋白表达水平，促进β-catenin核转位，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进乳腺癌细胞的体外增殖、侵袭和迁移; 6.在乳腺癌组织和细胞中，ZNF276、CYP1B1及β-catenin三者之间的表达呈正相关(P＜0.05且r＞0); 7.ZNF276通过招募黑色素瘤相关抗原B2(melanoma-associated antigen B2，MAGEB2)促进CYP1B1转录，激活Wnt/β-catenin信号通路。 结论: ZNF276通过招募MAGEB2蛋白调控CYP1B1，促进β-catenin核转位，激活Wnt/β-catenin通路，从而促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移。
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