摘要
本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 妊娠晚期母鼠宫内炎症对子代健康的影响 背景：母体妊娠期发生炎症反应会导致不良的新生儿结局，甚至可能会增加出生以后的健康风险。 目的：观察和记录母鼠在妊娠晚期遭受宫内炎症后，新生鼠出生时期的不良结局，以及评估子代出生以后的神经行为功能。 方法：①对每只CD1母鼠在E17当天宫内注射PBS（100μL）或LPS（25μg LPS溶于100μL的PBS），构建宫内炎症模型。②观察和记录母鼠暴露于LPS诱发的宫内炎症后，发生早产、死胎、死产情况。③比较PBS组和LPS组的新生鼠出生体重、出生后生存时间。④对正常期分娩出生后第5天（PND5）和第9天（PND9）的小鼠分别进行了悬崖回避反射和平面翻正测试，评估LPS小鼠出生后的神经行为能力。 结果：①LPS孕鼠的早产率达到73.1%（38/52），而PBS孕鼠无早产发生；68.4%（26/38）的早产发生于LPS术后24h内（＜E18），31.6%（12/38）的早产发生于术后24-48h（E18-19）。②76.3%（29/38）的早产孕鼠分娩出的新生鼠出现死亡；仅9只（9/38）早产孕鼠能分娩出活着的小鼠；89.0%（398/447）的早产新生鼠分娩后即死亡；LPS宫内注射24h以内的胎死率显著高于注射后24-48h的胎死率（99.3%vs67.6%，P＜0.01）。 结论：①母鼠在妊娠晚期遭受宫内炎症后，发生早产、死胎、死产及低出生体重的风险显著增高。②新生鼠在胎儿时期暴露于宫内炎症后，出生后的生存时间降低，且神经行为功能受损。③LPS作用后，24h以内是胎鼠存活的一个关键时间窗口。 第二部分 母体炎症对小鼠胎盘结构及其mTOR信号通路的影响 背景：LPS引起宫内/胎盘炎症后，会导致小鼠胎儿生长受限甚至死亡，表明宫内/胎盘炎症会影响小鼠胎盘的营养运输功能。mTOR信号通路是胎盘的营养功能的“感受器”。因此，我们推测LPS诱发的宫内/胎盘炎症可能会影响小鼠胎盘结构及其mTOR信号通路。 目的：探究小鼠遭受宫内炎症暴露后，胎盘的结构及其mTOR的活性是否发生变化。 方法：①应用HE染色对妊娠终末期的胎盘进行组织学分析。②利用组织免疫荧光检测胎盘组织的Vimentin表达情况，分析胎盘组织的内皮细胞骨架成分。 结果：①同PBS组相比，LPS组在注射后6h，胎盘迷路层组织结构松散，组织间空隙增多，血细胞浸润数量显著减少；在注射后24h，胎盘迷路层结构无显著变化，血细胞浸润数量仍显著减少。②同PBS组相比，LPS组在注射后6h，Vimentin在胎盘迷路层的分布显著减少；但在24h，LPS胎盘的Vimentin在迷路层分布无显著变化。 结论：①LPS诱发的宫内炎症可能通过激活小鼠胎盘NFκB的活性，促进小鼠胎盘免疫因子的分泌，从而对小鼠胎盘造成损伤，但这种损伤存在时间上的差异性。②LPS诱发的急性宫内炎症可导致小鼠胎盘在不同的时间点出现不同的mTOR活性。③小鼠胎盘p-4Ebp1在LPS注射后的早期表达降低，后期恢复至正常水平，提示p-4Ebp1的表达持续降低可能是胎鼠发生宫内死亡的一个信号。④小鼠胎盘p-rpS6在LPS诱发的急性宫内炎症和IL-1β诱发的系统慢性炎症中，表达均增高，提示p-rpS6可以作为胎鼠遭受炎症暴露后的一项敏感指标。⑤首次揭示了母鼠暴露于炎症后，小鼠胎盘不同的解剖区域表现出不同的mTOR活性，即蜕膜层和连接层mTOR活性下降或不变，而迷路层的mTOR活性增高。 第三部分 母鼠宫内炎症对胎脑发育的影响及相关机制 背景：本研究的第一部分揭示了LPS诱发的宫内炎症会导致小鼠出生后神经行为功能异常，第二部分发现了LPS诱发的宫内炎症引起了小鼠胎盘mTOR信号发生变化，提示小鼠胎盘的营养运输功能出现异常变化，影响小鼠胎脑的营养或能力摄取，继而可能会影响小鼠胎脑的发育和功能。 目的：观察母鼠遭受过宫内炎症暴露后，小鼠胎脑的发育是否异常，并探索其相关的分子机制。 方法：①构建LPS诱发的宫内炎症模型。②采用尼氏染色，比较PBS组和LPS组小鼠胎脑的皮质层厚度及皮质层神经细胞数量。③利用免疫荧光和蛋白免疫印迹，检测胎脑的Iba1表达水平，来判断小胶质细胞的活性状态。④通过组织免疫荧光检测Ki67的强度，观察胎脑的脑室周围神经细胞的增殖能力。 结果：①母鼠在E17遭受宫内LPS暴露24h后，LPS组与PBS组的小鼠胎脑皮质厚度无显著性改变，但胎鼠大脑皮质神经细胞的数量在LPS组显著性减少（P＜0.001）。②LPS作用于胎鼠24h后，LPS组小鼠胎脑的Iba1表达水平显著高于PBS组（P＜0.01）。③LPS作用于胎鼠24h后，LPS胎脑的Ki67阳性区域显著低于PBS组（P＜0.05）；LPS胎脑的cleaved Caspase3的表达水平显著高于PBS组（P＜0.01）。④LPS作用于胎鼠24h后，LPS小鼠胎脑的p-mTOR（P＜0.01）、p-4Ebp1（P＜0.001）、p-S6k（P＜0.01）、p-rpS6（P＜0.05）及t-rpS6（P＜0.05）的蛋白水平均显著降低，t-mTOR，t-4Ebp1及t-S6k在PBS组和LPS组之间无显著性差异；在2h，LPS胎脑mTOR的下游活性增加，表现为p-4Ebp1（P＜0.01）、t-4Ebp1（P＜0.01）、p-S6k（P＜0.001）及t-S6k（P＜0.01）的表达量显著增高；在6h，仅p-rpS6（P＜0.05）的表达量在LPS胎脑中显著降低。⑤t-mTOR、t-4Ebp1、t-S6k及t-rpS6几乎表达于整个胎脑，p-4Ebp1主要表达于脑室周围，少量分布于皮质区，p-rpS6主要表达于胎脑皮质区和海马区；p-mTOR与p-S6k未发现阳性信号。⑥在LPS暴露后24h，LC3的相对表达量或相对活性在PBS组与LPS组之间没有显著性改变。 结论：胎鼠在妊娠晚期暴露于宫内炎症后，胎脑的发育受到损伤，胎脑的小胶质细胞过度激活，胎脑脑室周围神经细胞的增殖能力下降，胎脑细胞的总体凋亡水平增加，这可能与胎脑的mTOR信号受到抑制有关。 第四部分 雷帕霉素对宫内炎症导致的新生小鼠不良结局的治疗作用 背景：根据前面的研究结果，我们发现了宫内炎症可以激活小鼠胎盘的mTOR下游信号rpS6的磷酸化活性，以及促进炎症早期的胎脑mTOR活性增加。因此，我们推测mTOR下游活性被抑制或许可以减少因宫内炎症导致的新生小鼠的不良结局。 目的：探索mTOR信号抑制剂雷帕霉素对由宫内炎症导致的新生小鼠不良结局的治疗效果。 方法：①待E17的孕鼠LPS手术完毕，按每只孕鼠0.01mg的药物剂量对母鼠进行腹腔注射雷帕霉素，待1h之后，再给予等量的雷帕霉素，观察早产和胎儿存活情况，并对出生后的小鼠进行行为试验。②蛋白免疫印迹检测胎盘rpS6的磷酸化水平。 结果：①雷帕霉素不能减少由LPS导致的早产发生率（64.0%vs75.9%，P＞0.05），但是该药能够显著提高LPS胎鼠的存活率（46.0%vs30.6%,P＜0.01）。②相对于LPS组，施加了雷帕霉素的小鼠，其行为表现为PND5的悬崖回避时间（P＜0.05）以及PND9的平面翻正反应（P＜0.05）的时间均显著缩短。③同LPS组相比，注射了雷帕霉素的LPS小鼠胎盘的p-rpS6的表达量显著降低（P＜0.05）。 结论：雷帕霉素可以提高LPS子代小鼠的存活率和改善LPS子代的神经行为能力，这可能与雷帕霉素抑制了LPS胎盘的p-rpS6过度活化有关。 第五部分 自发性早产儿胎盘的mTOR活性变化 背景：第一及第二部分的研究发现母体炎症可以导致小鼠早产、低出生体重甚至死胎，并引起胎盘的mTOR通路发生异常变化。另外，研究表明新生儿早产与宫内炎症密切相关。 目的：验证自发性早产的新生儿胎盘mTOR活性是否发生与因母体炎症而早产的小鼠胎盘的mTOR活性一致的变化。 方法：①收集了人胎盘和脐带静脉血样本，包括早产样本（PTB组）5例和足月产样本（NC组）4例。②ELISA法检测脐带血IL-1β和IL-6的含量。③蛋白免疫印迹检测胎盘母体面和胎儿面的mTOR下游rpS6和4EBP1的磷酸化活性。 结果：①早产儿的胎盘重量明显低于足月的胎盘（515.0±139.0vs660.0±53.5g，P=0.092），但差异没有统计学意义；早产儿发育的多个相关指标显著低于37周左右的足月儿，包括出生体重（2402.0±405.3vs3512.5±545.2g，P=0.01）、头围（31.2±1.5vs33.6±1.3cm，P=0.04）、腹围（38.4±1.5vs42.2±1.3cm，P=0.005）和股骨长（6.42±0.2vs7.05±0.3cm，P=0.011）。②早产儿脐带血IL-1β（P＜0.05）和IL-6（P＜0.01）的含量均显著增高。③早产胎盘的胎儿面rpS6的磷酸化活性增高（P＜0.05）。 结论：自发性早产儿的发生可能与胎儿暴露于炎症有关，早产儿胎盘胎儿面的rpS6活性增高，进一步证明了p-rpS6可以作为胎盘或胎儿遭受炎症应激的一个敏感分子。
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