摘要
黑素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，中晚期黑素瘤预后极差。目前黑素瘤的治疗仍然面临巨大挑战。大剂量IFN-α2b是FDA批准的ⅡB-Ⅲc期黑素瘤术后的辅助治疗，然而IFN-α2b副作用大，80%患者难以耐受大剂量而被迫减量或停药。尽管近年来免疫检查点阻断剂和靶向药物已改善了黑素瘤患者的生存率，但仍有相当多的黑素瘤患者对这些新开发的药物无反应或存在治疗抵抗。重组人IFN-α1b为我国开发的第一个具有自主知识产权的基因工程Ⅰ类新药，目前在病毒性疾病，血液系统肿瘤等方面得到了广泛应用。既往Ⅰ期临床试验结果表明，在接受重组人IFN-α1b治疗8周以上的18例转移性恶性肿瘤患者中，有5例肾细胞癌和1例恶性血管内皮瘤的无进展生存期超过1年，提示IFN-α1b具有潜在的抗肿瘤作用。本课题组应用IFN-α1b治疗黑素瘤10余年，发现IFN-α1b治疗的副作用显著低于IFN-α2b，而且疗效也显著优于IFN-α2b。不仅可作为Ⅱ、Ⅲ期黑素瘤术后的辅助治疗，对Ⅳ期黑素瘤也有显著疗效。我们最新的回顾性分析一组以IFN-α1b治疗Ⅳ期黑素瘤，结果表明患者中位生存期高达14.1个月，只有7.8%的患者首次用药时发生以高热为主的严重不良事件（未发表的数据）。经改进使用方法后，近两年近500例的应用中未再发生过40℃以上高热的严重不良事件。这些数据提示IFN-α1b是黑素瘤治疗的重要药物。然而，尽管我们应用IFN-α1b治疗黑素瘤已800余例，但仅限于临床观察研究，一直未对其作用机制进行探讨，国内外亦无相关研究报道。 目的： 1.比较IFN-α1b和IFN-α2b对黑素瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 2.比较IFN-α1b和IFN-α2b对黑素瘤抗肿瘤免疫的影响。 方法： 1.CCK-8实验检测IFN-α1b/IFN-α2b对黑素瘤细胞增殖的影响。 2.流式细胞术检测IFN-α1b/IFN-α2b对黑素瘤细胞凋亡的影响。 3.划痕实验检测IFN-α1b/IFN-α2b对黑素瘤细胞迁移的影响。 4.Transwell实验检测IFN-α1b/IFN-α2b对黑素瘤细胞侵袭的影响。 5.收集45例黑素瘤患者治疗前外周血提取PBMC，用单独的培养基或含有IFN-α1b或IFN-α2b的培养基刺激PBMC。 6.流式细胞术检测IFN-α1b/IFN-α2b对PBMC凋亡的影响。 7.乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测IFN-α1b/IFN-α2b对PBMC的细胞毒性作用。 8.流式细胞术分析IFN-α1b/IFN-α2b对NK细胞，NKT细胞，CD3+CD8+T细胞的免疫调节作用。 9.流式细胞术检测IFN-α1b/IFN-α2b对黑素瘤细胞表面HLA-ABC表达的影响。 10.酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测IFN-α1b/IFN-α2b对PBMC产生Granzyme B，TNF-α和IFN-γ的影响。 11.流式细胞术检测IFN-α1b/IFN-α2b对CD3+CD8+T细胞表面PD-1/PD-L1和黑素瘤细胞表面PD-L1表达的影响。 结果： 1.高浓度IFN-α1b对黑素瘤细胞增殖抑制作用及促凋亡作用强于IFN-α2b。 2.IFN-α1b对黑素瘤细胞迁移和侵袭能力的抑制作用与IFN-α2b无显著差异。 3.IFN-α1b和IFN-α2b均能增强黑素瘤患者NK细胞，NKT细胞和CD3+CD8+T细胞的活性，两者之间无统计学差异。 4.IFN-α1b和IFN-α2b均能增强黑素瘤细胞表面HLA-ABC表达，两者之间无统计学差异。 5.IFN-α1b和IFN-α2b均能增强黑素瘤患者PBMC中Granzyme B水平，两者之间无统计学差异。 6.IFN-α1b和IFN-α2b对黑素瘤患者PBMC中TNF-α水平无显著影响。 7.IFN-α1b和IFN-α2b均可增强黑素瘤患者PBMC中IFN-γ水平，但IFN-α1b作用弱于IFN-α2b。 8.与IFN-α2b相比，IFN-α1b不增加CD3+CD8+T细胞表面PD-L1的表达，对黑素瘤细胞（PD-L1）表达的诱导作用更弱。 结论： 1.研究结果显示，IFN-α1b与IFN-α2b对免疫细胞活化作用基本相同，IFN-α1b临床治疗效果优于IFN-α2b的机制可能不是基于两种IFN-α对免疫细胞活化等差异。 2.IFN-α1b对黑素瘤细胞生长抑制作用和促凋亡作用显著强于IFN-α2b，可能是IFN-α1b临床治疗效果显著优于IFN-α2b的重要机制。此外，IFN-α1b毒副作用小，临床治疗时患者能耐受高于IFN-α2b2~5倍的剂量，从而使IFN-α1b获更加优越的疗效。 3.IFN-α1b对负向免疫调节分子PD-L1的诱导作用显著低于IFN-α2b，可能也是IFN-α1b临床疗效更佳的机制之一。
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