摘要
兔球虫病对兔养殖行业造成的经济损失巨大。目前，对兔球虫的防治仍以化学合成药物为主，主要在饲料或饮水中加入抗球虫药物来预防，但长期使用会造成药物残留和耐药性的产生。因此，疫苗仍是抗球虫病的首选防治手段。本研究通过临床收集的兔球虫卵囊人工感染幼兔，28d剖杀后，在肝脏收集到一株球虫株，后经过复壮、不同方法致弱后观察体外孢子化率。以不同免疫剂量免疫幼兔，观察不同检测指标，选择最佳的兔球虫疫苗后，在吉林省兔场进行免疫保护性实验，进行效果观察。具体内容如下： 1.通过离心沉淀法、饱和食盐水漂浮法和Sheater蔗糖溶液纯化方法对分离的斯氏艾美尔球虫进行纯化，根据球虫寄生部位、形态学、分子生物学方面鉴定，获得一株E.stiedai球虫虫株。 2.采用不同物理和化学方法对未孢子化卵囊进行预处理后在进行体外孢子化。结果表明，甲醛致弱组、化学致弱组、紫外线致弱组和超声波致弱组相比于阳性对照组，体外孢子化率差异均显著（P＜0.05），说明四种方法均有效。将四组不同致弱方法体外孢子化率进行分别进行组间比较，差异显著（P＜0.05），说明超声波组抑制体外孢子化率最佳。其中化学致弱剂组致弱（10d，20d，30d，40d和50d后），组内比较，差异不显著（P＞0.05），表现为致弱30d后，E.stiedai体外孢子化率有较大降低趋势55.77±0.66%。将甲醛致弱剂组组内比较,差异显著（P＜0.05），说明甲醛组在浸泡96h后，抑制其体外孢子化率致弱效果最佳43.34±1.66%。紫外线组组内体外孢子化率进行组内比较，差异显著（P＜0.05），表明紫外线组在80min时，抑制其体外孢子化率致弱效果最佳，孢子化率为45.90±0.65%。超声波组进行组内比较后，组内差异极显著（P＜0.01），说明超声波组对球虫超声40min后，抑制体外孢子化率效果最佳34.12±1.22%。 3.甲醛组、化学致弱组、超声波组、紫外线组按每只幼兔接种卵囊数3×103个、6×103个，12×103个，共免疫2次。然后进行OPG、相对增重率、肝重指数、肝脏病变积分、存活率等免疫效果观察。OPG指标结果可知，不同致弱组幼兔排出卵囊OPG值分别与阳性对照组相比，甲醛组、化学致弱组、超声波组、紫外线组聚差异显著（P＜0.05）,超声波组OPG效果最好；将超声波致弱组组内不同免疫剂量相比，6×103个/只共免疫2次超声波组OPG排出量最低，13d，20d，28d的幼兔粪便OPG分别为1.16±0.25，0.36±0.05和0.14±0.01，差异显著（P＜0.05）。相对增重率指标结果可知，甲醛组、化学致弱组、超声波组、紫外线组与阳性对照组相比差异显著（P＜0.05），说明4组致弱组幼兔体重在免疫后，体重明显增加。不同致弱组进行相互对比，4组相对增重率效果差异显著（P＜0.05）,说明超声波组致弱效果最好，将超声致弱组组内相对增重率进行显著性分析（P＜0.05）,说明6×103个/只免疫后超声波致弱组增重效果最佳76.58±1.88%。超声波组、紫外线组与阳性对照组试验组组间存活率相比，差异显著（P＜0.05），说明超声波组和紫外线组存活率高。而肝脏病变积分致弱四试验组与阳性对照组相比，差异显著（P＜0.05），但将四组间甲醛组、化学致弱组、超声波组、紫外线组四组肝脏病变积分进行比较可知，差异显著（P＜0.05）,超声波6×103个/肝变积分0.65±0.39为最小数值，说明其免疫剂量对肝脏保护作用最好。肝重指数指标，致弱四个试验组的肝重指数分别于阳性对照组相比，差异显著（P＜0.05），说明幼兔免疫后，肝重变小。不同致弱试验组的肝重指数组间相比，差异不显著（P＞0.05），但超声波组数值呈现最小数值，超声波组致弱后，6×103个/只，肝重指数最低2.21±0.33。肝功能指标结果显示，致弱四个试验组的肝功能8个指标分别于对照组相比，四个致弱组的ALT、AST、ALB、TBIL、LDH、ALP、GGT和CHE与阳性对照组相比，差异显著均差异显著（P＜0.05），说明兔的肝功能状态改善。将试4种不同致弱组进行比较，超声波组超声波组的肝功8个指标ALT、ALB、LDH、CHE相比于其他组，差异显著（P＜0.050），说明超声波组效果最好，超声波组组间肝功8个指标不同剂量相比，差异显著（P＜0.05），说明超声波组6×103个/只免疫剂量8个指标数值最低，分别为ALT（30.02±4.23）、AST（23.88±1.11）、ALB（21.43±4.12）、TBIL（2.65±0.01）、LDH（165.51±11.21）、ALP（52.19±2.13）、GGT（5.21±0.08）和CHE（148.19±1.66）免疫效果最好。ELISA实验显示试验组IgG OD值血清随时间延长，总体呈现升高趋势（P＜0.05）。将4组致弱组血清OD值分别组间比较，超声波致弱组OD值35d明显高于其他3组，差异显著（P＜0.05），说明超声波组免疫效果最好；超声组组内相比，差异显著（P＜0.05），说明超声波组6×103个/只OD值高于其他免疫剂量组。因此，甲醛组、化学致弱组、超声波组、紫外线组按照不同免疫剂量OPG、相对增重率、肝重指数、肝脏病变积分、存活率等免疫效果观察，超声波组免疫剂量6×103个/只兔体内抗斯氏艾美耳球虫免疫效果最好。 4.挑选35日龄幼兔进行免疫，将制备的超声波弱毒苗依次加入幼兔的饲料和饮水中，每个兔场进行免疫栋数和未免疫栋数的平均划分。具体免疫剂量每只兔子接种剂量经过前期预实验摸索为6×103个/只后，共免疫2次（7日龄、14日龄）。将卵囊拌入饲料或加入饮水中进行两次免疫，从OPG、相对增重率和OD值可以看出，免疫栋数的预防兔球虫的效果好于未免疫栋数（P＜0.05），说明该超声波致弱疫苗免疫效果较好。
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