摘要
斑潜蝇种类繁多，不断向世界各地入侵扩散，在其过程中种间竞争取代频繁。三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii，美洲斑潜蝇L.sativae和南美斑潜蝇L.huidobrensis是入侵我国危害严重的三种多食性斑潜蝇。三种近缘斑潜蝇有着相似的形态特征和重叠的生态位，但它们的竞争能力不同，其中已有研究表明，三叶斑潜蝇与其近缘种相比拥有更强的入侵和竞争能力。在影响入侵性斑潜蝇竞争取代的诸多因子中，温度的作用不容忽视。而有关斑潜蝇物种竞争和温度适应性已有一些研究报道，但对其内在的分子机制和相关基因调控的研究至今未见报道。本研究首先通过对三种近缘斑潜蝇转录组和温度耐受性相关基因(Hsps)的比较，探究三种斑潜蝇竞争力强弱的分子证据;然后针对竞争优势种三叶斑潜蝇进行温度胁迫下的转录组测序，分析与温度胁迫相关的基因和调控通路;同时对温度胁迫下差异表达的关键基因家族-小分子量热激蛋白基因（sHsps）和热休克转录因子基因（Hsf1）的功能进行研究;最后以重要小分子量热激蛋白20.8基因（Hsp20.8)为对象探讨小分子量热激蛋白基因转录调控的分子机制。主要研究结果如下: (1)三种近缘斑潜蝇转录组比较研究结果表明，三种斑潜蝇虽然具有不同的共同差异表达的基因簇，但在差异表达基因两两比较中，三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇差异表达基因数目相似，显著的高于南美斑潜蝇。同时也发现，三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇在一些与竞争相关的基因表达模式上相近，而与南美斑潜蝇显著的不同。此外，基于5条不同Hsps家族基因序列特征及表达模式的比较研究表明，三叶斑潜蝇无论在非编码区的TATA-box-like元件数目，还是Hsps表达模式中的起始显著表达温度(Ton)和表达量最高的温度(Tmax)值，都表现出其在温度适应能力方面高于美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇。 (2)通过对三叶斑潜蝇温度胁迫转录组测序和分析表明，在经历高、低温胁迫下的三叶斑潜蝇中共鉴定并注释了超过3000个显著差异表达的单基因(Unigene)。GO、COG和KEGG通路富集分析表明，三叶斑潜蝇在高、低温胁迫下，涉及与“翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣”和“脂质转运代谢相关”的差异表达基因被显著地富集。热激蛋白和表皮蛋白基因分别在三叶斑潜蝇的高温和低温应激反应组的差异基因中被大量的注释。其中在高温胁迫下Top10差异表达基因中sHsps是表达倍数和数量都相对较高的基因家族。 (3)采用RACE和qPCR对三叶斑潜蝇中小分子量热激蛋白（sHsps）和热休克转录因子（Hsf1）基因进行全长克隆和表达模式研究，在三叶斑潜蝇中共获得5条sHsps和1条Hsf1。表达模式显示，预蛹和蛹是sHsps表达量最高的虫态;在三叶斑潜蝇蛹中，不同高低温胁迫下sHsps都能被显著诱导表达;在三叶斑潜蝇成虫中，随着温度的升高，sHsps也随着升高，但有趣的是Hsf1表达量却随着温度的升高而下降;在40℃不同处理时间和恢复时间下，Hsf1表达量随着处理时间的增加又逐渐的增加，同时恢复组的表达量显著低于未恢复组。为了进一步阐明Hsf1与sHsps之间的相互作用，在三叶斑潜蝇成虫中通过RNA干扰(RNAi)来敲低Hsf1的表达，结果表明敲低Hsf1的表达降低了高温胁迫下三叶斑潜蝇的存活率和Hsp19.5、Hsp20.8和Hsp21.3的表达水平。 (4)利用pET28a载体构建Hsf1重组蛋白原核表达质粒对三叶斑潜蝇Hsf1进行原核表达纯化，并利用Western Blot检测验证目的蛋白。采用GenomeWalker法扩增Hsp20.8的启动子序列，使用JASPAR在线工具分析预测Hsp20.8启动子中的HSE元件位置，并设计引物进行凝胶迁移实验(EMSA)实验，结果显示Hsf1蛋白可以与启动子中的第三个HSE序列结合。同时使用双荧光素酶报告基因方法，分析不同区域Hsp20.8启动子序列的转录活性，结果显示Hsp20.8启动子区各区域均具有转录活性，但PGL3-20.8-2+PRL-TK的活性最高。此外扩增不同地理种群的Hsp20.8启动子进行比较分析，邻接(NJ)法构建进化树结果显示，按照纬度高低Hsp20.8启动子分为两支，且与采样点的地理分布模式类似。此外各地理种群突变位点数目统计发现，在Hsp20.8启动子-2(-573～-382bp)和Hsp20.8启动子-3(-383～-192bp)片段突变位点较多，总的来说Hsp20.8启动子片段中突变位点数越多，其转录活性越高。因此三叶斑潜蝇不同地理种群Hsp20.8启动子区域的差异可能导致不同地理种群温度耐受能力的不同，造成南北地理种群分化并不断向北扩散传播。 本研究通过对三种近缘斑潜蝇的转录组和温度胁迫相关关键基因（Hsps）的比较，选择竞争优势物种三叶斑潜蝇为研究对象。以温度作为竞争因子，采用转录组测序分析，重要基因功能和调控机制研究，来揭示三叶斑潜蝇温度影响下的种间竞争及其温度耐受性的分子机制。研究结果为揭示斑潜蝇物种之间的竞争取代分子机制和三叶斑潜蝇入侵扩散中的温度胁迫耐受性机制研究具有重要理论意义。此外，基于三种斑潜蝇竞争力和温度胁迫耐受性潜在的差异分析，有针对性的采用不同的防控策略，这对斑潜蝇的入侵监测及防控具有重要意义。
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