摘要
人参作为我国中药的珍贵药材。它具有调节人体抗炎作用、镇定安眠、抗糖尿病等人体多种药理功能。一开始，研究人员发现：新鲜的人参通过高温加热的方式加工生成红参的过程中的化学成分人参皂苷中的糖基的C-20处发生了脱水反应，水解生成异构体，裂解形成大量的活性小分子物质：次生人参皂苷。次生人参皂苷又叫稀有皂苷，只能从原人参皂苷转化而形成，从生物学角度讲，它们具有更高的生物活性。而在热裂解过程中形成的次生人参皂苷又称之为“热裂解人参皂苷”。基于红参受热发生热裂解的理论基础上，为了获取到比红参更多的次生皂苷，研究人员通过反复多次高温高压蒸煮的方式，即“九蒸九曝”，获取稀有皂苷获得了黑参。本文基于人参高温热裂解生成次生人参皂苷的科学理论试验基础，采用高温热裂解法直接从人参皂苷中提取得到次生人参皂苷。利用提取方法，成功开发和制备了活性高、浓度高的稀有人参皂苷。 目的：通过热裂解法制备热裂解产物，为得到浓度较高的稀有人参皂苷优化出最佳的生产工艺条件。对人参皂苷Rb1其主要的热裂解产物之一的人参皂苷Rk1进行体外抗肿瘤药物实验以及深入开展的体外抗肿瘤药物作用机制分析研究。 方法：（1）RSM响应面试验确定热裂解产物Rk1和Rg5最佳工艺条件：TLC薄层分析法验证热裂解现象以及筛选影响因素、HPLC验证热裂解成分以及单因素实验完成三水平参数的设定。（2）研究热裂解产物Rk1诱导Hela细胞凋亡作用分析：CCK-8法检测给药Rk1后对细胞的抑制作用、流式细胞仪分析给药不同浓度的人参皂苷Rk1后细胞在各周期段活性占比的变化、用荧光显微镜观察给药不同浓度的人参皂苷Rk1后细胞被Hoechst33258染色后细胞核凋亡比例、流式细胞仪分析给药不同浓度的人参皂苷Rk1后细胞细胞早期以及晚期的凋亡率、Western blot分析给药Rk1后对细胞凋亡蛋白水平的调节作用（3）RNA-seq法研究Rk1抗宫颈癌作用初步机制：找出差异基因蛋白、做GO、KEGG富集分析、RT-qPCR验证测序趋势的准确性、Western blot验证蛋白表达含量、寻找宫颈癌治疗的可能的潜在新的靶点。 结果：（1）TLC薄层分析法验证结果为：人参皂苷Rb1可发生热裂解反应以及人参皂苷热裂解法主要有酸浓度、反应温度、反应时间三个因素所决定；HPLC验证结果为：人参皂苷Rb1被证实可在一定条件下发生化学反应生成人参皂苷20（R）-Rg3、20（S）-Rg3、Rk1和Rg5；通过薄层分析法筛选出的三因素做后续单因素试验，根据试验结果筛选三水平做响应曲面法优化试验，最终结合理论与实践，该工艺流程下人参皂苷Rk1和Rg5的最佳工艺条件确定为酸浓度A为1.6%、时间B为46min、温度C为111℃。（2）Rk1的最佳浓度为10-30μM，最佳处理时间为24h，得出Rk1以剂量依赖性的方式将Hela细胞阻滞于G0/G1期，20μM和30μM药物剂量时的Hela细胞在细胞周期的G0/G1期的细胞存活率显著增大（p＜0.01），同时，20μM和30μM药物剂量时的Hela细胞呈现明显的浓度依赖性，在细胞周期的S期和G2/M期的细胞存活率降低，通过抑制细胞分裂从而抑制细胞增殖。Hoechst33258染色经Rk1处理后的Hela细胞，随着Rk1给药浓度的增大，细胞凋亡比例显著增加。定量检测细胞凋亡率可以得出结论：Rk1对Hela细胞的增殖表现出显著的抑制作用，随着Rk1浓度的增大，细胞凋亡率的百分比以剂量依赖性的方式显著增加，从4.28±0.47%增加至12.39±0.99%（p＜0.001）。其抑制作用主要归因于Rk1可诱导Hela细胞凋亡的发生，增加了Hela细胞的早、晚期凋亡率。最后，通过免疫蛋白印迹分析来检测凋亡蛋白的表达。人参皂苷Rk1作用Hela细胞24h，能够显著增加Caspase-3、LC3B、Caspase-6、PARP蛋白表达水平。证明人参皂苷Rk1能够明显激活Caspase-3、PARP和Caspase-6的细胞凋亡信号通路从而发挥促凋亡作用。人参皂苷Rk1可显著增加自噬标志物LC3B蛋白表达水平，证明Rk1通过自噬信号通路促进自噬性细胞死亡。（3）GO分析发现，三个浓度梯度的Rk1（10μM、20μM、30μM）处理后的Hela细胞主要上调的信号通路包括：细胞骨架，转移酶活动，核糖核酸绑定，细胞对DNA损伤刺激反应等。下调的信号通路主要有：凋亡过程的负调控，内质网应激，内质网中蛋白质折叠，蛋白质运输，钙离子结合，细胞骨架等。KEGG分析结果表明，绝大多数与细胞增殖相关的基因、细胞周期基因、细胞衰老相关的信号通路均出现了表达下调，同时，内质网蛋白质加工信号通路出现下调。通过GO富集、KEGG富集以及Western blot实验和实时定量RT-qPCR验证，发现YOD1蛋白在所有蛋白中受Rk1的剂量抑制作用最显著，找到了宫颈癌治疗的潜在的新的靶点-YOD1。 结论：人参皂苷可以通过热裂解法将原有的皂苷转化为次级人参皂苷，这些次级人参皂苷具有更高的活性。通过对Rb1热裂解皂苷Rk1对癌细胞抗癌作用机制，得到的结论是：RK1在体外抗肿瘤实验中均表现出显著的抗肿瘤作用，RK1可诱导Hela细胞发生凋亡。
NETL