摘要
湖北海棠（Malus hupehensis（Pamp.）Rehder，M.hupehensis）是苹果属重要的观赏性植物，其叶富含多糖、多酚和类黄酮等物质，具有抗氧化、抗高血糖、抗肿瘤等多种药理活性。传统多糖提取方法存在提取时间长、操作复杂、经济成本高等缺点。双水相体系（Aqueous two-phase system，ATPS）由两种不混溶聚合物或一种聚合物和盐与水组成，广泛应用于多糖、蛋白质和其他生物分子的一步提取和纯化。与传统的萃取方法相比，双水相是一种绿色、高效的萃取溶剂体系，为目标化合物提供了一个温和、生物相容的环境，具有操作简便、相离快、溶解性好等优点。本研究的目的是：（1）利用响应面法优化湖北海棠多糖（Malus hupehensis polysaccharide，MHP）的提取条件，建立一种基于超声辅助双水相体系（UAATPS）的快速有效的提取方法；（2）利用化学分析和现代色谱分析方法对MHP进行初步表征；（3）对MHP的抗氧化活性以及降血糖活性进行初步研究。研究结果如下： （1）比较不同乙醇-盐离子ATPS条件下的MHP提取率，其中乙醇-硫酸铵体系提取率相对较高，因此选取乙醇-硫酸铵体系采用单因素和响应面试验进行工艺优化。单因素试验结果表明，对MHP提取率具有显著影响的因素有超声功率、超声时间和料液比，而温度对其影响不显著。响应面优化结果表明最佳提取条件为：在30.31%（w/w）乙醇和19.86%（w/w）硫酸铵的双水相中，提取温度50℃、超声功率65W，超声时间33min，料液比为1∶23（g/mL），MHP的收率为47.63%，纯度为83.63%。 （2）采用紫外全波长扫描、傅里叶红外光谱（FTIR）、高效液相色谱（HPLC）、刚果红试验、圆二色谱（CD）和扫描电子显微镜（SEM）对MHP结构进行表征。结果表明，UAATPS提取的MHP不含或含有极少量的核酸和蛋白质，说明UAATPS提取可有效去除MHP中的核酸和蛋白质等杂质，提高MHP纯度。通过HPLC进行单糖组成分析，MHP是由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成，摩尔比为3.22∶1.85∶4.25∶5.08∶6.69∶38.46∶4.68∶30.90∶4.87。刚果红试验和CD分析表明MHP具有三螺旋和不对称结构。 （3）化学法测定结果表明MHP具有较好的抗氧化活性和抑制晚期糖基化终末产物（AGEs）活性。细胞试验结果表明MHP可显著提高胰岛素抵抗（IR）L02细胞对葡萄糖的消耗率，同时能够降低IR细胞内甘油三酯（TG）、丙二醛（MDA）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）以及总抗氧化能力（T-AOC）水平，具有较好的抗氧化活性和降糖活性。 综上所述，本文采用响应面优化UAATPS提取MHP工艺，并对获得的MHP进行初步结构表征，通过化学法和细胞生物学法研究MHP体外抗氧化和降糖活性，但仍需进一步对其活性进行研究以及探究其作用机制。本文为从植物中提取多糖提供了一种绿色、简便、高效的技术参考，为提高湖北海棠叶的附加值以及促进其综合利用提供理论依据。
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