摘要
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease2019，COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2）引起的一种烈性人兽共患病，具有传染性强、死亡率高等特点，人、水貂、犬和猫科动物均易感。2020年3月11日，世界卫生组织（WHO）宣布该病进入全球大流行状态，成为100年来最为严重的“国际关注的公共卫生事件”和“百年一遇的重大危机”。截至2021年3月9日，新冠肺炎已蔓延至212个国家和地区，累计确诊病例117,647,370例，死亡病例2,607,383例，对全球公共卫生安全造成巨大威胁。目前，SARS-CoV-2的中间宿主动物尚不明确。虽然已有研究表明犬、猫可以携带SARS-CoV-2，但带毒的伴侣动物是否会向人类传播SARS-CoV-2尚未明确。因此，研发安全、有效的SARS-CoV-2兽用疫苗，预防猫、犬等伴侣动物群和水貂等特种经济动物种群感染SARS-CoV-2，对减少动物向人类传播感染SARS-CoV-2的潜在风险具有重大意义。 目前有204种新冠疫苗处于研发阶段，其中80种进入了人类临床试验，10余种疫苗已经进入Ⅲ期临床试验。处于研究前沿的疫苗有灭活疫苗、mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗以及亚单位疫苗，国内外已有3种灭活疫苗，2种mRNA疫苗及1种腺病毒载体疫苗批准上市。然而，针对兽用新冠疫苗的研究却相对较少。本文建立了SARS-CoV-2抗体间接ELISA检测方法，同时制备了针对SARS-CoV-2的刺突蛋白（Spike protein，S）的受体结合域（Receptor Binding Domain，RBD）蛋白的细菌样颗粒疫苗（BLPs），并对其免疫原性进行了初步研究。具体研究内容如下： 1.SARS-CoV-2RBD蛋白的原核表达与纯化 扩增SARS-CoV-2RBD基因并构建重组表达质粒pET30a(+)-RBD，转化宿主菌BL21（DE3）后诱导表达目的蛋白，优化表达条件（表达时间、表达温度和诱导剂浓度），利用His-Ni+柱进行目的蛋白纯化。研究结果表明目的蛋白以包涵体形式存在，分子质量大小约为32KDa，37℃条件下，诱导剂浓度0.6mmol/L，诱导5h时表达量最高，经BCA法测定，每升诱导重组菌液可纯化18mg目的蛋白，且蛋白纯度＞90％。Western blot结果显示目的蛋白可与兔抗SARS-CoV-2S1多克隆抗体产生特异性反应条带，表明重组蛋白的反应原性良好，为后续建立特异性SARS-CoV-2抗体检测方法奠定基础。 2.SARS-CoV-2抗体间接ELISA检测方法的建立 以纯化后的重组RBD蛋白为包被抗原，高免马血清为一抗，HRP标记的兔抗马IgG为二抗，建立检测SARS-CoV-2RBD特异性IgG抗体的间接ELISA方法，并优化其工作条件。最佳检测条件：抗原包被浓度为1μg/mL、37℃封闭1.5h、待检血清37℃孵育2h、二抗稀释度为1∶2000。对该间接ELISA检测方法的特异性进行评价，结果显示，该检测方法与严重急性呼吸综合征冠状病毒1型（SARS-CoV-1）、埃博拉病毒（EBOV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、猫传染性腹膜炎病毒（FCoV）、裂谷热病毒（RVFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和马尔堡病毒（MARV）的阳性血清均不产生交叉反应，表明该间接ELISA检测方法具有良好的特异性和重复性，为后续SARS-CoV-2血清学检测奠定了基础。 3.SARS-CoV-2细菌样颗粒的构建与鉴定 首先，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建及拯救带有SARS-CoV-2RBD片段的重组杆状病毒rBV-RBD-linker-PA3，鉴定正确后批量表达融合蛋白RBD-linker-PA3。其次，利用MG1363乳酸乳球菌制备GEM颗粒，并与融合蛋白RBD-linker-PA3结合形成细菌样颗粒GEM-RLP3。基因组PCR鉴定显示重组杆状病毒构建成功；间接免疫荧光和Western Blot结果表明，成功表达融合蛋白RBD-linker-PA3且该蛋白呈可溶性表达；间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western Blot结果表明，融合蛋白成功展示在GEM颗粒表面，且具有良好的特异性；经SDS-PAGE和灰度分析结果表明，融合蛋白与GEM颗粒的锚定结合量为208.3μg/U。对处理前、后的乳酸乳球菌与结合融合蛋白的GEM颗粒进行冷冻切片分析，结果表明GEM颗粒和GEM-RLP3细菌样颗粒均制备成功，为本研究细菌样颗粒疫苗的实验免疫研究提供了免疫原。 4.SARS-CoV-2细菌样颗粒的实验免疫研究 将GEM-RLP3颗粒与弗氏佐剂混合，制备SARS-CoV-2细菌样颗粒疫苗免疫小鼠，以单纯佐剂组和PBS组为对照，对该疫苗的免疫原性进行初步评估。首次免疫后检出中和抗体，但中和抗体效价较低；第一次和第二次加强免疫的血清中和抗体效价平均值为1∶426和1∶597；三次免疫后的小鼠血清特异性IgG抗体检测结果分别为1∶2048、1∶32768和1∶65536；ELISpot检测、脾淋巴细胞增殖水平和细胞因子分泌水平检测结果表明，该疫苗免疫小鼠后可有效促进脾淋巴细胞增殖，促进Th1和Th2相关细胞因子的表达。表明SARS-CoV-2细菌样颗粒疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性，可以诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。 综上所述，本研究中制备的SARS-CoV-2细菌样颗粒具有良好的免疫效果，可刺激机体产生特异性细胞免疫与体液免疫应答，为SARS-CoV-2兽用新型疫苗的研发奠定前期基础。
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