摘要
豆科植物与根瘤菌建立的共生固氮作用被广泛研究和应用，在农业、环境、经济等方面都具有重大的应用价值。目前，众多研究者从根瘤菌、宿主植物及外界环境等方面入手，不断更新和完善根瘤菌-豆科植物共生固氮的分子机理。作为共生信号途径的关键基因，结瘤因子受体（Nod Factor Receptors,NFR）发挥着至关重要的作用。结瘤因子受体是一类LysM型受体，识别结瘤因子（Nod Factor,NF）并激活共生信号传导途径，最终导致根瘤菌入侵宿主植物，并形成根瘤。而对于根瘤衰老，除了外界因素的影响，还引发了一系列生理生化变化，其中就包括了半胱氨酸蛋白酶基因（Cysteine proteases,CYP）的表达。将LjNFR1-LjNFR5共转入蒺藜苜蓿并接种M.loti MAFF303099可结瘤，在此基础上，本文第一章以大豆（Glycine max）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、百脉根（Lotus japonicus）nfr突变体为材料，探索大豆、百脉根的NFRs结构及其功能，旨在扩大根瘤菌的宿主范围。第二章以百脉根MG20为材料，探索LjCYPs在根瘤衰老中的作用，为后期提供理论依据和实验材料。主要研究结果如下： 1．将LjNFR1-LjNFR5共转互补Gmnfr5突变体可以和大豆根瘤菌共生结瘤，但不能与百脉根根瘤菌共生结瘤。而GmNFR1α-GmNFR5α共转互补Mtnfp突变体时并不能与大豆根瘤菌共生结瘤。 2．以GmNFRs、LjNFRs为研究对象，通过改变NFRs的胞内域结构、胞外域结构，分别互补Ljnfr1、Ljnfr5突变体，并接种百脉根根瘤菌NZP2235/LacZ。结果表明GmNFR1α不能互补Ljnfr1突变体，而GmNFR5α能完全互补Ljnfr5突变体正常结瘤，也说明LjNFR胞外域是一个绝对保守的结构，在共生过程中起着至关重要的作用，影响着共生能否正常进行。 3．利用生物软件分析得到8个可能与根瘤衰老相关的LjCYPs，以此为基础进行Real-time PCR检测8个LjCYPs在百脉根根瘤后期的表达，结果表明Lj1g3v4047290.1、LjCYP1、LjCYP3、LjCYP5均在根瘤后期（7-10w）表达量呈上调趋势，尤其是LjCYP5上调趋势明显。 4．利用CRISPR-Cas9体系及百脉根毛根转化技术分别单敲除LjCYP3、双敲除LjCYP1-LjCYP5，结果表明百脉根根瘤基因组均发生了编辑，以碱基缺失与插入为主，最终影响百脉根根瘤固氮效率及衰老。第一，利用TUNEL法检测接种7w根瘤时，单敲除LjCYP3与双敲除LjCYP1-LjCYP5均可有效延缓根瘤凋亡与衰老；第二，利用乙炔还原酶法检测接种9w时根瘤的固氮酶活，单敲除LjCYP3与双敲除LjCYP1-LjCYP5均能极显著提高根瘤固氮酶活；第三，从根瘤衰老情况来看，单敲除LjCYP3时红瘤显著多于对照，双敲除LjCYP1-LjCYP5时红瘤极显著多于对照而衰老根瘤极显著少于对照。
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