摘要
玉米秸秆、玉米芯等农作物纤维素类物质资源储量丰富，国内每年产生的秸秆和林业废弃物高达八亿吨。这些可再生生物质资源的清洁利用日益受到人们的不断重视。木质纤维素被复合纤维素酶糖化后，进一步被发酵微生物转化为酒精、乳酸、聚乳酸等生物产品。本课题以经过原子束Co-60诱变筛选出的绿色木霉（Trichoderma viride）R16做为出发菌株，研究了其以秸秆为底物产纤维素酶的最佳发酵条件，并利用质谱分析了纤维素酶组分；分析了NH3-H2O2预处理秸秆后产生的抑制剂对纤维素酶发酵的影响情况；同时，摸索了其应用于木质纤维素转化乳酸的可行性，获得了以下研究结果： 1.确立了绿色木霉R16在摇瓶培养条件下诱导表达复合纤维素酶的最优培养基组成与培养条件。在4g/L玉米浆干粉做为氮源，30%种子液添加量，30g/L NH3-H2O2预处理秸秆浓度下，28℃发酵120h纤维素酶酶活从0.51滤纸酶活（FPU）/mL提高至1.09FPU/mL，提升程度为114.57%。同时发现水洗后20g/L，25g/L，30g/L秸秆浓度下纤维素酶酶活分别提高57.46%、45.99%、21.52%。 2.在摇瓶培养优化的基础上，进行了5-L发酵罐产纤维素酶的分批与补料放大实验。葡萄糖在约24h耗竭，T.viride R16相继启动半纤维素酶和纤维素酶的表达，最终在水洗秸秆补料发酵实验中，纤维素酶酶活达到1.85FPU/mL，木聚糖酶酶活达到121.32U/mL。 3.NH3-H2O2预处理过程中木质素降解产生的抑制剂（以香兰素、对羟基苯甲醛、丁香醛为代表）对T.viride R16发酵的影响结果显示：1.0g/L的对羟基苯甲醛和香兰素对细胞生长和纤维素酶发酵产生强烈抑制，0.2g/L情况下抑制作用并不明显。T.viride R16对丁香醛具有较强的降解能力，在1g/L浓度下，可以降解87%丁香醛。 4.T.viride R16酶液酶解玉米芯及同步糖化发酵产乳酸实验表明：8%玉米芯为底物，2.0FPU/mL T.viride R16纤维素酶酶液添加量下，葡萄糖产量10.93g/L，木糖27.80g/L，玉米芯糖转化率为0.48g/g玉米芯。以相同玉米芯底物和酶量情况下，凝结芽孢杆菌LA204同步糖化乳酸发酵实验获得32.87g/L乳酸，乳酸对玉米芯转化率达到0.44g/g。 5.对发酵酶液进行蛋白质全谱扫描分析共681个蛋白质和2314条多肽链被鉴定出。进行了以iBAQ值代表蛋白质摩尔数量的相对定量分析，其所产纤维素酶组分包括0.74%内切葡聚糖酶Ⅰ型，13.77%内切葡聚糖酶Ⅲ型，6.75%内切葡聚糖酶Ⅳ型，2.39%内切葡聚糖酶Ⅶ型,7.96%外切葡聚糖酶Ⅱ型和0.92%的β-葡萄糖苷酶，总的纤维素酶组分在iBAQ值排名前50的蛋白质中共占40.06%。此外还发现3类半纤维素酶组分，纤维素溶胀因子、信号转导蛋白等辅助降解纤维素的酶类，以及对抑制物有降解作用的芳香族化合物双加氧酶也发现在酶混合液中。 木质纤维素转化生产乳酸的过程中高昂的酶液成本及预处理后产生的抑制剂的抑制作用是制约其大规模应用的两大主要障碍。本研究利用发酵工艺优化策略，采用廉价秸秆做为诱导原料，利用突变的绿色木霉R16菌株生产可降解木质纤维素的复合酶添加剂，在秸秆乳酸发酵过程中降低了木质纤维素转化过程中的酶液成本。
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