摘要
背景：骨质疏松症是一种代谢性骨病，其特征是骨量和骨微结构减少，主要原因是破骨细胞生成增加和/或破骨细胞骨吸收增强，导致失控的骨丢失，主要影响绝经后妇女。鉴于目前治疗骨质疏松症药物的严重副作用，开发新的安全有效的药物势在必行。扁蒴藤素(Pristimerin，PRI)是从卫矛科和海棠科植物中提取的一种喹啉亚甲基三萜化合物，具有很强的抗肿瘤和抗炎作用。然而，它对破骨细胞的作用仍不清楚。 目的：该研究的目的是通过动物、细胞和分子水平的系统研究，明确扁蒴藤素在破骨细胞分化、骨吸收以及绝经后骨质疏松中的作用，并探讨扁蒴藤素作用于破骨细胞的潜在机制，寻求控制破骨细胞分化的新靶点。 方法：（1）通过CCK-8实验评估不同浓度的扁蒴藤素干预不同时间（48h、96h）对骨髓源性巨噬细胞的生存影响，确定合适的体外药物使用浓度，排除药物毒性对后续实验造成影响。 （2）用RANKL刺激骨髓源性巨噬细胞分化成破骨细胞，随后使用TRAP染色，测定多核破骨细胞的数目、面积，评价扁蒴藤素以浓度及时间依赖的方式对破骨细胞的形成的影响。通过F-actin染色，检测扁蒴藤素对肌动蛋白环的形成的影响。通过在骨片上种植骨髓源性巨噬细胞，检测扁蒴藤素对破骨细胞骨吸收功能的影响。 （3）采用聚合酶链反应技术，检测扁蒴藤素以浓度及时间依赖的方式对RANKL诱导的骨髓源性巨噬细胞相关基因（DC-STAMP,CTSK,c-Fos,TRAP,V-ATPased2及NFATc1）表达水平的影响。 （4）通过蛋白质印记的方法评估扁蒴藤素短期刺激后的骨髓源性巨噬细胞相关的蛋白 （IκBα，P65NF-κB通路与ERK,p38及JNKMAPK通路及AKT通路）表达水平的变化及长期刺激分化成破骨细胞过程中相关的蛋白（C-Jun，C-Fos及NFATc1）表达水平的变化。 （5）利用OVX绝经后骨质疏松模型，将18只8周龄雌性C57小鼠随机分为3组，空白对照组，OVX组，OVX+药组，每2天加一次药，对照组、OVX组加相应生理盐水，八周后处理小鼠，收集小鼠双侧股骨及胫骨。以双侧股骨做力学实验，micro-CT分析胫骨参数（骨体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨小梁连通性密度(Conn.D)和结构模型指数(SMI)），HE染色及TRAP染色方法进行组织学定量分析。 结果：（1）首先我们在体外实验中确定了扁蒴藤素的安全有效浓度。然后在安全药物浓度下验证了扁蒴藤素抑制破骨细胞分化和骨吸收,并在体外下调破骨细胞标记基因的表达,包括C-FOS和NFATc1等。在分子层面,扁蒴藤素主要通过抑制RANKL诱导的ERK、JNKMAPK和AKT信号通路的早期激活，进而抑制关键破骨细胞转录因子NFATc1的诱导和激活,最终抑制了破骨细胞的分化。 （2）最后我们通过构建了OVX绝经后骨质疏松模型，发现扁蒴藤素能够增强股骨力学性能，增加胫骨各项骨参数，改善小鼠卵巢切除导致绝经引起的骨丢失。 结论：综上所述，我们的研究结果表明，扁蒴藤素在体内外都具有抗破骨细胞分化的作用，具有成为骨质疏松治疗药物的潜力。
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