摘要
【目的】 肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌（Non-smallcelllungcancer，NSCLC）占据了肺癌的85%左右。近期研究发现亚甲基四氢叶酸脱氢酶2（Methylenetetrahydrofolatedehydrogenase2，MTHFD2）在多种肿瘤中上调，我们前期研究发现MTHFD2与NSCLC的发生发展密切相关，但关于MTHFD2抑制剂的相关研究较少，且目前尚无MTHFD2抑制剂应用于肿瘤的临床治疗。因此，本研究设计合成了新型MTHFD2小分子抑制剂C18，并研究了其抗NSCLC活性及机制，以推进MTHFD2抑制剂在肿瘤临床治疗中的应用，改善肿瘤患者预后。 【方法】 通过免疫印迹实验检测MTHFD2在临床NSCLC组织及癌旁正常组织的表达水平。采用三种人NSCLC细胞系（PC-9，H460和H1975），通过细胞毒性实验（MTT）、克隆形成实验评估MTHFD2及C18对NSCLC细胞活力影响；通过划痕实验、Transwell实验评估MTHFD2及C18对NSCLC细胞迁移和侵袭的影响，并通过免疫印迹实验评估上皮细胞-间充质转化（Epithelial-MesenchymalTransition,EMT）相关蛋白（E-Cadherin，Vimentin和Snail）的表达水平；通过Hoechst染色、流式细胞术评估MTHFD2及C18对NSCLC细胞凋亡的影响，并通过免疫印迹实验评估凋亡相关蛋白CleavedpolyADPribosepolymerase（CleavedPARP）,B-celllymphoma-2（Bcl-2）和Bcl-2AssociatedXProtein（Bax）的表达水平；通过分子模拟对接、免疫印迹实验、ELISA实验评估C18对MTHFD2的靶向抑制作用。利用H1975细胞系构建小鼠异种移植瘤模型，研究C18在小鼠体内的抗NSCLC效果，同时利用HE染色评估C18的体内毒性，利用免疫印迹实验检测肿瘤组织MTHFD2,Bcl-2,Vimentin,Snail,CleavedPARP,Bax和E-cadherin的表达水平。 【结果】 1.MTHFD2蛋白在临床NSCLC患者中高表达： 通过对收集的8对人NSCLC组织样本及其毗邻正常组织样本的免疫印迹分析，发现NSCLC组织样本的MTHFD2蛋白表达量显著高于毗邻正常组织。 2.敲低MTHFD2可抑制离体人NSCLC细胞的克隆形成、迁移、侵袭及EMT： 利用siRNA敲低MTHFD2后，对人NSCLC细胞的克隆形成、细胞迁移、细胞侵袭能力的影响及对EMT相关蛋白表达的影响。 2.1克隆形成实验：与对照组相比，敲低MTHFD2后H1975细胞的克隆形成能力下降。 2.2细胞划痕实验：与对照组相比，敲低MTHFD2后H1975细胞的迁移能力显著下降。 2.3Transwell侵袭实验：与对照组相比，敲低MTHFD2后H1975细胞的侵袭细胞比例明显减少，侵袭能力显著下降。 2.4免疫印迹实验：与对照组相比，敲低MTHFD2后EMT相关蛋白E-Cadherin表达水平明显增高，Vimentin和Snail表达水平显著降低。 3.小分子抑制剂C18可抑制离体人NSCLC细胞MTHFD2的表达： 本研究设计、合成、并筛选出了小分子化合物C18，并对其抑制MTHFD2的作用进行评估。 3.1分子对接模型：利用LY345899与MTHFD2蛋白的模型进行分子对接模型预测，发现C18可以占据LY345899与MTHFD2的结合位置并分别与残基ASN87、LYS88和GLN132形成3个氢键。 3.2免疫印迹实验：在人NSCLC细胞中，C18抑制了MTHFD2的表达，相同浓度的C18作用时间越长，抑制效果越明显，相同作用时间下，C18浓度越高抑制效果越明显，呈显出浓度和时间依懒性。 3.3酶联免疫吸附实验：在人NSCLC细胞中，C18抑制了MTHFD2表达，相同作用时间下，C18浓度越高抑制效果越明显。 4.C18可抑制离体人NSCLC细胞的增殖、克隆形成能力: 4.1MTT实验：C18抑制了人NSCLC细胞增殖，C18浓度越高，对细胞的增殖抑制越明显。GraphpadPrism软件对相对细胞生存率进行分析，结果显示C18在人NSCLC细胞中的IC50值在2-5μM间。C18对Beas-2b细胞的毒性较低，其IC50值为19.36μM，是3种NSCLC细胞的平均IC50值的5倍多。 4.2克隆形成实验：C18抑制了人NSCLC细胞的克隆形成，相同作用时间下，C18浓度越高抑制效果越明显。C18对Beas-2b细胞的克隆形成没有明显的影响。 5.C18可抑制离体人NSCLC细胞的迁移和侵袭能力: 5.1划痕实验:C18显著抑制了人NSCLC细胞的迁移能力，C18浓度越高，对细胞的迁移抑制越明显。 5.2Transwell侵袭实验：C18显著抑制了人NSCLC细胞的侵袭能力，C18浓度越高，对细胞的侵袭抑制越明显。 5.3免疫印迹实验：C18上调了EMT相关蛋白E-Cadherin表达水平，且下调了Vimentin和Snail表达水平，并呈浓度依赖性。 6.C18能诱导人离体NSCLC细胞凋亡: 6.1流式细胞术（凋亡）实验：C18显著上调了人NSCLC细胞的凋亡比例，诱导了细胞凋亡。 6.2Hoechst染色实验：C18作用于人NSCLC细胞后，在荧光显微镜下呈现蓝色致密浓染的细胞比例增加，C18诱导了细胞凋亡。 6.3免疫印迹实验：C18促进了促凋亡蛋白CleavedPARP与Bax的表达，抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。 7.体内动物实验验证C18可通过下调MTHFD2抑制NSCLC进展： 7.1体内动物实验验证C18可抑制NSCLC进展 构建H1975细胞的小鼠异种移植瘤模型，并应用C18处理后，发现C18降低了NSCLC肿瘤的体积，减轻了NSCLC肿瘤的重量；C18作用后小鼠的体重没有明显的变化，且心、肝、肺、肾重要脏器的HE染色没有发现明显的毒性作用。 7.2体内动物实验验证C18可促进NSCLC肿瘤凋亡及影响凋亡蛋白的表达 剥离C18处理后的肿瘤组织样本，并应用免疫印迹实验分析其凋亡相关蛋白的表达水平，发现动物体内C18促进了NSCLC肿瘤中促凋亡蛋白CleavedPARP与Bax的表达，抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。 7.3体内动物实验验证C18可抑制肿瘤EMT及影响EMT相关蛋白的表达 剥离C18处理后的肿瘤组织样本，并应用免疫印迹实验分析其EMT相关蛋白的表达水平，发现动物体内C18上调了NSCLC肿瘤中E-Cadherin表达水平，且下调了Vimentin和Snail表达水平。 7.4体内动物实验验证C18可抑制MTHFD2表达 剥离C18处理后的肿瘤组织样本，并应用免疫印迹实验分析其MTHFD2蛋白的表达水平，发现动物体内C18显著抑制了NSCLC肿瘤中MTHFD2的表达水平。 【结论】 MTHFD2作为一种癌基因促进NSCLC的增殖、迁移及侵袭，新型小分子化合物C18在体内及体外均能通过抑制MTHFD2发挥抗NSCLC的作用，且具有良好的安全性。本研究结果显示C18作为MTHFD2抑制剂，有望成为临床治疗NSCLC的潜在候选药物。
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