摘要
目的： 优化皮肤和肾皮质细胞外基质水凝胶的制备过程，并使用交联剂对其进行改性并评估其机械性能、生物相容性等，判断交联的程度并筛选适宜的交联剂浓度。为得到更具有普适性的水凝胶，将皮肤和肾脏皮质水凝胶以一定配比混合并探究其作为生物打印墨水的潜力。 方法： 1.制备皮肤和肾皮质细胞外基质支架 在去除猪毛和猪皮下组织后，将新鲜的猪皮切成均匀大小的块并用水充分冲洗。使用机械震荡法对猪皮进行去细胞处理，0.1%SDS作为去污剂，持续搅拌72小时（每24小时更换一次去污剂）。 从猪肾外侧沿冠状面把肾脏一分为二后，将肾脂肪囊、肾窦和肾髓质进行剥离，保留外层厚度约为1-1.5cm的肾皮质部分并将其切成5×5×5mm3大小的块状。去细胞过程简要概述如下：先使用纯水对组织块进行冲洗，约6小时后根据实验分组将液体更换为0.1%、0.3%、0.5%的SDS溶液，持续搅拌24小时后换用纯水清洗残留去污剂。 2.病理学检测 通过对去细胞前后组织中DNA含量进行比较判断去细胞后核酸残留程度。通过组织学染色如HE染色、Masson三色染色、AB-PAS染色等评价去细胞后细胞外基质中主要成分如胶原、糖胺聚糖等的保留情况。 3.细胞外基质水凝胶的制备、交联改性及混合细胞外基质水凝胶的制备 去细胞支架组织在冷冻干燥后研磨成粉，经酸性胃蛋白酶水解，氢氧化钠中和后，在37℃恒温条件下可自组装成胶。依据实验分组在水凝胶成胶前加入不同浓度的京尼平对细胞外基质水凝胶进行交联改性。混合细胞外基质水凝胶则根据皮肤和肾脏水凝胶配比的不同进行制备。 4.水凝胶性能表征 通过多种技术手段对水凝胶进行表征，其中包括大体观察、扫描电镜观察、交联度检测、溶胀性能检测、体外降解速率检测、微观机械力学测定、傅里叶红外光谱和流变性能检测等。并使用凝胶电泳分析的方法对去细胞前后和胃蛋白酶消化前后主要蛋白组分的变化情况进行简要分析。 5.生物相容性实验 通过使用CCK-8和Liveamp;Dead细胞染色的方法检测在水凝胶材料上培养细胞的细胞存活率及生长状态。 建立大鼠肾下极缺损模型并用水凝胶材料进行注射修补。术后在第1、2、4周取材并对移植物进行组织学染色，进而判断支架降解的情况。 结果： 皮肤和肾脏去细胞后，分别呈现白色不透明状和白色半透明状，且在去细胞肾脏组织中能够观察到明显的血管网络。使用DNA含量测定和组织学染色的方式对去细胞效果进行评价。结果显示去细胞后组织中DNA含量显著降低，组织学染色中均未见明显细胞核组分。不仅如此，在去细胞组织中还保持着组织原有的空间构架，特别是在肾组织中依然可观察到明显的肾小球结构。除此以外，细胞外基质的主要成分如胶原纤维和糖蛋白等也得到了保留。 在制备皮肤细胞外基质水凝胶的过程中加入京尼平进行化学交联改性，成胶后原先呈白色的水凝胶变为了与京尼平剂量相关的深浅不一的蓝色。为进一步了解凝胶内部的变化情况，对凝胶断裂面进行电镜扫描，观察到水凝胶的空间结构随交联剂浓度的增加而更加紧密，但京尼平的加入并没有改变水凝胶中原有化学键的分布。使用多种方法对交联水凝胶性能进行表征后，各组水凝胶在交联程度和溶胀性能方面的差别并不明显，但在延缓水凝胶的降解和增强其力学性能方面均得到了提升。其中使用纳米压痕仪对水凝胶表面的微观力学进行测定的结果表明京尼平的浓度与水凝胶有效杨氏模量呈正相关。为进一步判断京尼平的安全浓度，利用细胞毒性实验筛选了不同浓度的京尼平对细胞增殖的影响，结果显示当京尼平浓度低于0.63mM时，对细胞几乎没有毒性。另外，在动物实验中，0.5mM的京尼平在体内具有良好的生物相容性。 为筛选最佳配比的混合细胞外基质水凝胶，制备了四种浓度四种配比的混合水凝胶。在这些水凝胶中，5mg/ml混合水凝胶成型差；在8mg/ml混合水凝胶中，皮肤肾脏水凝胶为1∶1时成型差，3∶1时成型性相对较好；10mg/ml和15mg/ml各组水凝胶均具有良好的成型性，反映了混合细胞外基质水凝胶的成型依赖于凝胶中胶原蛋白的含量。继而对优化后的混合水凝胶进行交联改性，在对改性后的混合水凝胶进行流变学测定后发现水凝胶具有明显的剪切稀化行为，适合进行3D打印。除此之外，在使用水凝胶进行细胞培养时，混合水凝胶表现出良好的生物相容性。这也说明了混合细胞外基质水凝胶具有作为生物墨水的潜力。 结论 在本研究中，我们优化了肾皮质去细胞的方案，这是稳定制备肾皮质细胞外基质水凝胶的基础。与单纯细胞外基质水凝胶相比，京尼平交联改性后的水凝胶具有更强的机械性能和更缓慢的降解速度，同时也具有良好的生物相容性。此外，在本实验中优化了肾脏和皮肤的混合细胞外基质水凝胶的浓度和配比。相较于单纯肾皮质细胞外基质水凝胶而言有着更优的凝胶特性，其明显的剪切稀化行为也为3D打印生物墨水的进一步研制及应用奠定了基础。
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