摘要
研究背景： 心脏是人体最重要的器官之一，心脏衰老直接关系到人类的寿命长短。随着年龄的增长，衰老的心肌会逐渐发生重构，包括心肌细胞凋亡与坏死，残余心肌的反应性肥厚，心肌间质纤维化，从而使心脏收缩功能下降，搏出量减少，心功能储备下降及心肌顺应性降低。此外，由于衰老引起的心肌损伤后代偿能力急剧下降，一旦老年患者发生心肌梗死将会出现越加严重的心力衰竭及恶性的心肌重构，严重影响老年患者的生活质量及生存率。目前，关于心脏衰老的机制仍不十分清楚。寻找或研发延缓心肌细胞衰老的有效措施对保护老年个体心脏功能，防治衰老相关心血管疾病的发生具有重要意义。 叶酸是一种水溶性B族维生素，在许多单碳代谢和参与核苷酸合成中起辅助因子的作用，参与体内核酸和氨基酸的合成及重要的生理反应。研究表明叶酸缺乏与心血管疾病、卒中以及阿尔茨海默氏症和帕金森病相关。近年来，老年相关研究发现，叶酸对衰老相关损伤具有一定的保护作用。补充叶酸能有效推迟老年性神经细胞退化和小鼠的认知能力下降,降低端粒功能障碍和衰老相关的表型。虽然叶酸在保护衰老方面的重要性似乎已被证实，但叶酸介导的心脏衰老保护机制仍不清楚。 内质网应激反应（endoplasmicreticulumstress）最初是对抗内质网中未折叠蛋白堆积有害影响的保护策略，然而，过度和/或长期的应激导致适应不良反应和细胞凋亡。近年来有研究显示，内质网应激功能下降与神经系统衰老密切相关，随着年龄的增长，ER适应性反应逐渐下降。尽管目前已经明确内质网应激在神经系统衰老和衰老调节中具有重要影响，但其在心肌衰老中是否也起到一定作用仍有待进一步研究。 因此，基于以上背景，本文计划研究叶酸在心脏衰老中的作用及及其作用是否与内质网应激信号通路相关。 研究方法： 第一部分：在动物模型中，观察叶酸对老年小鼠心脏衰老的影响。我们通过持续喂养4月龄及14月龄小鼠6个月来建立成年小鼠（10月龄）及老年小鼠（20月龄）模型。并将小鼠分成四组：A.成年小鼠标准喂养组：4月龄小鼠标准喂养6月；B.成年小鼠叶酸组：4月龄小鼠补充叶酸喂养6月（4mg/kg/day叶酸+标准喂养）;C.老年小鼠标准喂养组：14月龄小鼠标准喂养6月；D.老年小鼠叶酸组：14月龄小鼠补充叶酸喂养6月（4mg/kg/day叶酸+标准喂养）。喂养6月后取小鼠心脏组织，观察小鼠心脏功能、心肌肥大指标、心肌间质纤维化、心肌细胞凋亡、炎症因子水平、氧化应激水平、心肌衰老信号（P53、P21、P16）的变化以及内质网应激信号通路的表达。 第二部分：在体外水平诱导心肌细胞衰老观察叶酸对心肌细胞衰老的影响，探讨叶酸调节内质网应激的过程,揭示叶酸延缓心脏衰老的潜在机制。我们通过低剂量阿霉素诱导H9C2心肌细胞系建立心肌细胞衰老模型，同时给予叶酸干预，观察叶酸对心肌细胞衰老程度以及衰老信号P53、P21、P16表达的影响。同时检测内质网应激信号通路，观察叶酸在阿霉素诱导的心肌细胞衰老中对内质网应激信号通路表达的影响。并通过转染CHOPsiRNA至H9C2细胞来特异性抑制内质网应激信号蛋白CHOP的表达，从而进一步明确叶酸对心肌细胞衰老的保护作用是否与内质网应激信号通路相关。 研究结果： 第一部分 1.经过6个月的补充叶酸喂养能显著减轻老年小鼠的心肌肥厚，包括心脏重量/胫骨长度比值（HW/TL）(P＜0.05)、心肌细胞横截面积（transverseareaofthemyocytes）(P＜0.05)、小鼠游离心肌细胞面积（isolatedmyocytesurfacearea）(P＜0.05)，并降低心脏组织心房利钠肽（ANP）以及脑钠肽（BNP）的水平。 2.经过6个月的补充叶酸喂养能显著改善老年小鼠超声心动图的左心室重构及左心功能参数，包括左心室质量（LVmass）(P＜0.05)、左心室后壁厚度（LVposteriorwallthickness）(P＜0.05)、左心室舒张末直径（LVend-diastolicdiameter）(P＜0.05)、左心室舒张末体积(LVend-diastolicvolume)(P＜0.05)、射血分数(ejectionfraction,EF)(P＜0.05)。 3.经过6个月的补充叶酸喂养能显著减少老年小鼠心脏间质纤维化及血管周围纤维化水平(P＜0.05)、同时减轻衰老诱导的心肌细胞凋亡(P＜0.05)。 4.经过6个月的补充叶酸喂养能显著降低老年小鼠心脏组织炎症因子的表达（TNF-α,IL-1β，IL-6）(P＜0.05)以及氧化应激的水平（8OHDG、MDA）(P＜0.05)。 5.经过6个月的补充叶酸喂养能显著减轻老年小鼠心脏组织衰老程度(P＜0.05)，同时抑制衰老相关信号蛋白的表达（p53/p21/p16）(P＜0.05)。 6.老年小鼠内质网应激功能受损(P＜0.05)，而经过6个月的补充叶酸喂养能改善老年小鼠心肌内质网应激功能(P＜0.05)。 第二部分 1.低剂量阿霉素（0.2umol/L）处理H9C2心肌细胞系成功在体外建立心肌细胞衰老模型。 2.体外叶酸干预能显著减少阿霉素诱导的心肌细胞衰老(P＜0.05)，同时抑制衰老相关信号蛋白的表达（p53/p21/p16）(P＜0.05)。 3.在阿霉素诱导的心肌细胞衰老模型中，叶酸干预能提高衰老心肌细胞内质网应激信号蛋白（eif2a、BIP）的活化水平(P＜0.05)，同时抑制促凋亡CHOP的表达(P＜0.05)。 4.在阿霉素诱导的心肌细胞衰老模型中，通过转染CHOPsiRNA至H9C2细胞来特异性敲除CHOP的表达，阿霉素诱导心肌细胞衰老的作用被抵消(P＜0.05)。 结论： 1.补充叶酸喂养能显著减轻老年小鼠的心肌肥厚，防止左心室重构，改善小鼠心脏功能，降低心脏组织炎症反应及氧化应激，减少心脏纤维化及衰老诱导的心肌细胞凋亡，对老年相关的心脏损伤起一定的保护作用。 2.体内外研究均表明叶酸干预能抑制衰老相关信号蛋白的表达，从而延缓心肌细胞的衰老。 3.体内外研究均表明叶酸对心脏衰老保护作用的潜在机制与内质网应激信号通路相关。 4.通过阐明叶酸对心肌衰老的保护作用及其具体机制，完善心肌衰老的药物治疗，为老年心力衰竭患者提供新的治疗理论基础和实验依据。
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