摘要
背景与目的：酒精相关性肝病（alcoholicassociatedliverdisease，AALD）是肝损伤和衰竭的最常见病因之一。AALD由于其高患病率和较差的临床预后，严重影响了人类健康。目前，人们对AALD的潜在发病机制了解有限，极大地阻碍了AALD有效治疗方法的研究进展。胆汁酸信号通过与胆汁酸G蛋白偶联受体5（TGR5）结合参与AALD的调节，然而，胆汁酸介导调节AALD的分子机制仍然知之甚少。因此，本论文旨在深入研究胆汁酸/TGR5信号介导的AALD发病的分子机制，并根据这些分子机制合成靶向TGR5的新型激动剂，将对AALD治疗药物的开发提供新的靶标和先导小分子药物，具有重要科学意义与应用价值。 方法：利用C57BL/6J野生型(WT)、Tgr5基因敲除(KO)小鼠以及褐色脂肪组织Tgr5特异性敲低（KD）的WT小鼠，采用慢性酒精饲养加一次高浓度酒精灌胃，诱导AALD模型。应用伊红-苏木素染色、油红O染色和天狼星红染色检测肝脏病理表型、肝脏脂肪积累和纤维化程度。利用肝脏甘油三酯（triglycerides，TG）检测试剂盒检测肝脏TG水平。利用cleaved-Caspase-3免疫组织化学染色和TUNEL染色检测肝细胞凋亡水平。利用ALT和AST肝功能检测试剂盒检测肝功能。采用液相色谱/质谱（LC/MS）检测血清胆汁酸组成。用荧光素酶报告基因分析方法研究胆汁酸对TGR5的激活。用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹方法检测小鼠肝脏、脂肪组织、回肠以及酒精性肝炎患者的肝脏样本基因表达水平。TGR5激动剂DY284按照30mg/kg的剂量每天一次灌胃处理11天，用于检测和分析TGR5激动剂在AALD小鼠模型中的治疗效果。利用Crisper/Cas13方法构建褐色脂肪组织Tgr5RNA特异性敲低小鼠模型，用于进一步研究褐色脂肪组织在AALD中的功能 结果：酒精摄入上调了WT小鼠褐色脂肪组织中TGR5下游的产热基因，包括Dio2、Pgc1α、Prdm16和Ucp1的表达，显著上调WT小鼠能量消耗；Tgr5KO小鼠中则无此变化。因此，Tgr5缺失严重加剧了酒精摄入诱导的AALD症状。Tgr5RNAKD小鼠中也发现了一致的结果。酒精摄入改变胆汁酸合成酶和肠-肝循环转运蛋白的表达，从而影响了血清胆汁酸的水平和组成。酒精摄入改变的胆汁酸能激活TGR5。酒精摄入促进白色脂肪组织的脂肪分解，Tgr5KO严重阻碍了褐色脂肪组织中脂肪酸β氧化，导致血清脂肪酸（FFA）水平升高。因此，与WT小鼠相比，Tgr5KO小鼠肝脏对游离FFA的摄取增加，肝脏脂肪合成基因Fasn、Scd1的表达上调，脂肪β氧化基因Cpt1a、Cpt2、Acox1等表达下调，最终表现出更加严重的AALD。TGR5激动剂DY284显著激活褐色脂肪组织中的TGR5信号，促进产热，降低血清FFA水平，从而改善AALD模型小鼠的肝脏脂肪变性和肝损伤。DY284在Tgr5KO小鼠中未能体现这些效果。 结论：激活褐色脂肪组织的TGR5有利于改善AALD症状。TGR5可能作为AALD的有效治疗靶标。新型TGR5激动剂DY284有效改善AALD模型小鼠的症状，可能成为治疗AALD的有效手段或先导小分子药物。本研究为AALD的发病机理和治疗手段提供了新的依据，具有重要的科学意义与应用价值。
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