摘要
近年来，化学杀虫剂滥用导致的环境问题备受关注，以罗伯茨绿僵菌（Metarhiziumrobertsii）为代表的昆虫病原真菌可开发为具有生物防治功能的真菌杀虫剂，其被广泛应用于各种农林害虫的防治，在替代传统化学杀虫剂方面具有重要潜力。罗伯茨绿僵菌营寄生、腐生以及根际共生三种生活方式，既是研究真菌致病机制的模式生物，也是研究不同碳氮源营养物质应答机制的良好材料。罗伯茨绿僵菌的致病过程包括穿透昆虫体壁和定殖昆虫血腔，能否穿透体壁决定其侵染的成败，因此，深入认识罗伯茨绿僵菌穿透体壁过程中的致病机制可为提高真菌杀虫剂的效率提供重要的理论支持，但目前关于该过程的作用机制还远未阐明。此外，作为真菌杀虫剂的活性成分，罗伯茨绿僵菌分生孢子的产量和活力是决定真菌杀虫剂效率的重要因素。通过对其孢子发育过程的深入研究，可为真菌杀虫剂的改良提供一定的借鉴意义。本论文主要探究罗伯茨绿僵菌中受MAPK正调控的三个信号通路在穿透体壁过程中的致病机制以及孢子发育过程的调控机制，主要研究结果如下： 一.前期研究发现，Fus3正调控一个MYB家族转录因子RNS1(regulatorofnutrientselection1)，Rns1敲除突变体杀虫速度显著下降。本研究发现，在罗伯茨绿僵菌穿透体壁时，Fus3磷酸化RNS1第215位点的苏氨酸和第226位的丝氨酸。被磷酸化的RNS1进入细胞核，并与自身启动子区的顺式作用原件BM2位点（CCCAGAC）结合，诱导自身的表达。RNS1可直接调控体壁降解酶（脂酶、几丁质酶、蛋白酶）的表达，降解昆虫体壁的脂质、几丁质和蛋白质，获取营养而生长，并在昆虫体壁上打开通道，进入昆虫血腔。 除了调控利用昆虫体壁蛋白、几丁质和脂质之外，在仅含有非昆虫来源的复杂碳氮源营养物质（烷烃、酪蛋白以及几丁质）中，Fus3也会磷酸化RNS1，诱导Rns1的表达，进而诱导这些复杂碳氮源利用相关基因的表达。Fus3/RNS1级联体对复杂碳氮源利用相关基因的诱导受到优质有机碳氮源营养物质（如葡萄糖、谷氨酰胺）以及次优质有机碳氮源（精氨酸，脯氨酸，N-乙酰-葡萄糖胺，棉子糖，海藻糖）的抑制，但不受优质无机氮源物质硫酸铵的抑制。在碳氮源营养代谢过程中，我们没有鉴定到RNS1与已知的碳氮源调控因子（CRR1,AREA,G6PD,Tps1,Snf1,TORkinase）有直接相关性。 二．在PDA培养基上，Rns1敲除突变体?Rns1的菌落形态与野生型菌株WT有明显差异，菌落蓬松,产孢结构出现异常，甁梗结构明显减少，产孢量下降。进一步分析发现，RNS1主要在产孢结构的甁梗以及孢子中高水平表达。上述研究表明RNS1调控罗伯茨绿僵菌的孢子发育过程。 转录因子BrlA和AbaA所在的孢子中心发育通路调控罗伯茨绿僵菌的孢子发育过程，且BrlA直接调控AbaA的表达。本研究发现，BrlA存在BrlAα和BrlAβ两个转录本，BrlAβ转录本起始位点位于BrlAα转录本起始位点上游-835bp的位置。RNS1与BrlA启动子区的BM2位点结合后，通过调控BrlA的表达水平间接促进AbaA的表达。进一步分析发现，Slt2正调控RNS1介导的孢子发育过程。 三.前期的研究结果表明，转录因子AFTF1在穿透体壁的过程中调控附着胞的形成，Aftf1的表达受Fus3的正调控，但是调控机制并未阐明。在本研究中，我们进一步发现Fus3正调控转录因子Aftf1的过程是通过转录因子MrSt12介导的。MrSt12敲除突变体无法形成附着胞结构且完全丧失了致病能力。在穿透体壁过程中，Fus3与转录因子MrSt12互作对其进行磷酸化修饰，激活后的MrSt12与Aftf1启动子区的顺式作用原件（ATGAAACA）结合，诱导Aftf1的表达，从而调控罗伯茨绿僵菌的致病过程。作为Fus3调控的下游基因，转录因子RNS1、MrSt12、AFTF1均调控罗伯茨绿僵菌穿透昆虫，但RNS1和MrSt12/AFTF1并不相互调控，表明Fus3/RNS1和Fus3/MrSt12/AFTF1是两个相互独立的级联体。 综上所述，本论文发现MAPK与下游的三个转录因子分别组成Fus3/RNS1、Slt2/RNS1/BrlA/AbaA以及Fus3/MrSt12/AFTF1三个信号通路，两个含有Fus3的信号通路在调控昆虫体壁穿透时发挥重要作用，但二者之间并不相互调控。Slt2/RNS1通过控制孢子发育的中心调控通路调控孢子发育过程。
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