摘要
牛奶中富含脂肪酸，其中不饱和脂肪酸被证实具有抗氧化、消炎以及延缓肿瘤生长的保健作用。牛奶中不饱和脂肪酸的生成受到多个转录因子的调控，其中，肝X受体（liverXreceptor，LXR）是调节不饱和脂肪酸合成的关键因子。LXR有LXRα和LXRβ两种亚型，不同亚型调节机体脂质代谢和胆固醇稳态的机制不同。阐明LXRα和LXRβ对乳腺不饱和脂肪酸合成的差异机制，对提高牛奶的营养价值具有重要意义。本研究的目的在于探究LXR两种亚型在奶牛乳腺乳脂合成中的差异机制。 方法和结果: 1、体外培养奶牛乳腺上皮细胞，构建CRISPR/Cas9敲除载体，细胞转染，利用嘌呤霉素筛选出单克隆细胞。以单克隆细胞基因组为模板扩增出覆盖目标片段的DNA片段，进行基因比对。对发生碱基缺失单克隆细胞进行脱靶检测，RT-qPCR检测LXRα和LXRβ基因的表达量变化，Westernblot检测细胞LXRα和LXRβ的蛋白表达量。通过基因编辑技术敲除细胞后，获得LXRα和LXRβ基因敲除的奶牛乳腺上皮细胞各一株，其均发生脱靶效应，LXRα和LXRβ的蛋白敲除效率分别为50%和80%。 2、基于该敲除细胞株发现，在激动剂T091317处理24h，LXRα或者LXRβ基因敲除的乳腺上皮细胞与野生型细胞相比ACC、SREBP1c、SCD1和FADS1等基因的mRNA水平显著下降，FASN和ABCA1表达量差异并不显著。LXRα敲除后，ABCG1和FADS2表达量显著下降,但LXRβ基因对ABCG1和FADS2的表达没有显著影响。激动剂T091317处理24h后，与对照组相比，敲除LXRα或者LXRβ显著降低细胞中甘油三酯含量。经过激动剂T091317处理后，LXRα基因敲除导致饱和脂肪酸C16:0含量显著下降，C16:1含量显著升高，但不影响C18:0和C18:1cis的含量。LXRβ基因敲除细胞的含量无显著性变化。 3、利用转录组测序对LXRα和LXRβ调控乳脂合成差异机制研究。利用激动剂T091317处理敲除细胞，进行转录组分析，对差异基因进行GO和KEGG聚类分析。本研究发现与激动剂T091317处理野生型细胞相比，LXRα敲除细胞与LXβα敲除细胞在不饱和脂肪酸合成和脂质合成信号通路存在差异。 结论：LXRα和LXRβ在奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成中都发挥着作用，两者对SREBP1c、ACC、SCD1、FASD1等脂肪酸合成关键基因及甘油三酯合成调控作用。但LXRα和LXRβ对下游靶基因ABCG1和FADS2表达调控作用不同。LXRα对脂肪酸的组成成分的调控作用与LXRβ存在差异。转录组分析结果显示两种亚型在不饱和脂肪酸合成和脂质合成信号通路存在差异，造成两种亚型对乳脂合成调控作用不同。
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