摘要
艾克曼菌是一种肠道黏液层降解菌，其在改善人肠屏障功能和免疫反应方面有重要价值。全基因组分析发现艾克曼菌中有12个基因参与编码β-N-乙酰己糖胺酶，大部分属于GH20家族。这些酶能够切割特定的糖苷键，在艾克曼菌黏蛋白降解过程中起关键作用，其酶学特征及催化机制正被广泛研究。 本课题通过大肠杆菌异源表达系统获得了艾克曼菌β-N-乙酰己糖胺酶Am0868的重组蛋白。利用X射线晶体学的方法解析了Am0868及其和小分子GlcNAc复合物的晶体结构。同时体外测定了Am0868蛋白的底物特异性和生化特性，并构建了Am0868D326A和Am0868E327A突变体，通过对其进行动力学分析，验证了天冬氨酸（D326）和谷氨酸（E327）的催化作用。 结构解析表明Am0868整体结构由N端结构域和C端催化结构域组成。催化结构域呈典型的(β/α)8（TIM）桶状折叠，活性位点位于其中。小分子底物GlcNAc通过疏水和氢键相互作用与Am0868的催化活性中心结合。Trp376、Trp393和Trp474组成疏水口袋，帮助底物β-GlcNAc稳定在活性中心。Asp326和Tyr420对于正确定位底物2位乙酰氨基十分重要，而Glu327起到酸碱催化的作用。底物特异性测定结果表明Am0868偏好于水解β-GlcNAc构型的底物。Am0868对不含乙酰氨基的底物均无催化活性，说明底物的乙酰氨基部分对于酶催化是必不可少的。生化特性测定结果显示Am0868具有广泛的pH耐受性和较好的热稳定性，金属离子Zn2+、Cu2+、Cd2+和Ni2+会显著降低酶的活性。动力学分析发现，与野生型酶相比，突变体Am0868D326A的催化效率几乎全部丧失，E327A突变体仍保留部分酶活性。Am0868晶体学和突变研究结果证实了Asp326和Glu327是Am0868的关键催化残基。 本课题的研究结果揭示了天冬氨酸在艾克曼菌β-N-乙酰己糖胺酶Am0868底物辅助催化机制中的关键作用，并给Am0868体内黏蛋白水解潜力的研究提供详尽的生化信息。
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