摘要
圆锥角膜是一种角膜扩张性疾病，在临床中是较为常见的致盲性疾病之一。角膜是一种典型的承载组织，在眼内压的作用下角膜主要承受拉伸和剪切载荷的作用。圆锥角膜局部组织变薄、结构破坏、材料性能降低，导致角膜内部应力发生重新分布。多种炎性因子在圆锥角膜患者角膜组织、细胞及泪液过度表达。miRNAs作为重要的基因表达调控因子，与角膜的生理病理过程密切相关，miRNAs还与转录因子KLFs相互作用参与炎症介质的表达调控,KLFs家族是重要的调控炎症介质表达的转录因子之一。miRNAs和KLFs是否参与力学刺激下角膜中炎性因子的表达调控尚不清楚。本研究通过对体外培养的人角膜成纤维细胞进行不同时间的周期性机械拉伸，研究了力学刺激对人的角膜成纤维细胞中KLFs、炎性因子及基质重塑相关基因表达的影响；通过siRNA技术研究了KLF4与KLF5对角膜成纤维细胞中炎性因子及基质重塑相关基因表达的影响；同时筛选了能够同时靶定KLF4与KLF5且与其表达呈负相关的miRNAs，探究了miRNA是否通过KLFs调控人角膜成纤维细胞中炎性因子的表达，进而参与角膜基质重塑相关蛋白的调控。本文的主要工作如下： （1）对体外培养的正常人角膜成纤维细胞进行0h、3h、6h、12h的周期性机械拉伸，采用实时荧光定量PCR检测细胞中转录因子KLFs、白细胞介素（ILs）、基质金属蛋白酶（MMPs）、赖氨酰氧化酶（LOX）、胶原蛋白（COL）的基因表达。结果发现，在周期性机械拉伸的刺激下人角膜成纤维细胞转录因子（KLF4、KLF5）、炎性因子（IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1）、基质金属蛋白酶（MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13和MMP-14）的表达均显著上升，赖氨酰氧化酶样蛋白（LOX-1、LOX-2、LOX-4）和胶原蛋白（COL1A2、COL3A1）的表达显著下调。提示机械拉伸可以诱导人角膜成纤维细胞中转录因子KLFs、炎性因子及基质重塑相关基因的表达。 （2）构建KLF4与KLF5基因的siRNA干扰片段并分别转染到人角膜成纤维细胞中，采用实时荧光定量PCR检测人角膜成纤维细胞中KLF4与KLF5对炎性因子及基质重塑相关基因表达的影响。结果显示在干扰KLF4与KLF5表达后，人角膜成纤维细胞中除IL-1β外，IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13和MMP-14的表达也随之下降，而COL1A2、COL3A1、LOX-1、LOX-2和LOX-4的表达显著上升。提示KLF4与KLF5可以通过调控人角膜成纤维细胞中炎性因子（除IL-1β外）的表达，进而参与基质重塑相关蛋白的调控。 （3）通过miRBase和TargetScan网站预测能同时靶定KLF4与KLF5的miRNAs（miR-145-5p，miR-5195-3p）。对体外培养的人角膜成纤维细胞进行机械拉伸，通过实时荧光定量PCR检测KLF4、KLF5及上述miRNAs的表达。结果显示miR-145-5p与KLF4及KLF5的表达趋势相反，且在3h时最明显，故选取miR-145-5p做后续实验研究。 （4）分别将miR-145-5p的模拟物与抑制剂转染到体外培养的人角膜成纤维细胞中，检测转染后角膜成纤维细胞中KLFs、炎性因子及基质重塑相关基因的表达。结果显示miR-145-5p模拟物能够显著下调转录因子KLF4和KLF5的表达，同时使炎性因子IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13和MMP-14表达降低，COL1A2、COL3A1、LOX-1和LOX-2的表达升高。提示在机械拉伸刺激下miR-145-5p表达下降，引起KLF4与KLF5表达升高，促进炎性因子（除IL-1β外）和基质重塑相关蛋白（除LOX-4外）的表达。这可为圆锥角膜的发病机理和治疗提供了潜在靶点。
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