摘要
研究背景： 类风湿性关节炎（Rheumatoidarthritis，RA）是一种常见的以关节滑膜炎症为主要表现的自身免疫性疾病，其致残率高、危害性大。RA病因复杂，尚未完全阐明，也无有效治愈的特效药。临床治疗药物以改善病情抗风湿药(disease-modifyingantirheumaticdrugs,DMARDs)为主，包括传统合成csDMARDs、生物制剂bDMARDs和靶向合成tsDMARDs等。csDMARDs类的代表药甲氨蝶呤是国内外指南推荐的RA治疗首选药，但长期使用可发生胃肠道不适，肝毒性和心血管并发症等，导致部分患者不能坚持用药。bDMARDs和tsDMARDs是新近开发上市的药物，具有起效较快，疗效较好的特点。但个体差异显著，约20%患者在治疗结束时未达预期治疗目标。此外，药物价格昂贵，长期使用可发生感染和血液系统毒性等不良反应也限制了这两类药物的临床应用。因此，研发RA治疗新药一直是药学领域中的重点工作之一。 中药是中华民族的瑰宝，有着几千年的历史传承，是寻找RA治疗新药的宝贵资源。诃子（TerminaliaChebulaRetz）是一味民族药材，在藏药和蒙药中应用广泛，有“万药之王”之称。以诃子为主药组方的风湿止痛丸和扎冲十三味丸等成药制剂在临床被用于RA的治疗并显示出一定的疗效，曾有报道其症状缓解有效率在80%以上。现代药理学研究表明诃子提取物具有较好的抗炎活性。但现有关于诃子抗RA的主要活性成分还缺乏系统研究。而已有的药理活性研究主要集中在表型观察，缺乏深入的机制探讨。因此，亟需应用现代药理学研究方法，明确诃子治疗RA的主要活性成分，进而揭示其作用机制。本研究旨在推进诃子等中药的现代化研究，具有较为重要的意义和科学研究价值。 研究目的： 本研究首先拟通过网络药理学预测诃子治疗RA的潜在活性成分-靶点-通路。采用高分辨质谱法和高效液相色谱法结合对预测的潜在活性成分进行定性和定量分析。进而以LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型、IL-1β诱导MH7A细胞炎症模型和胶原诱导关节炎动物模型，从分子水平，细胞水平和整体动物水平，明确诃子抗RA的主要活性成分并初步探究其作用机制。为将诃子开发为治疗RA的新药提供新证据和新策略。 研究方法与结果 1.基于网络药理学预测诃子治疗类风湿性关节炎的潜在活性成分-靶点-通路 1.1潜在活性成分的确定 利用中药系统药理学技术平台（TCMSP）和公共数据库查找已有文献报道的诃子化学成分。潜在活性成分的确定原则为：1.同时满足口服生物利用度OB%＞30%和类药性DL＞0.18。2.不满足条件1但已有文献报道明确具有抗炎活性的成分。据此原则，共筛选出10个潜在活性成分，6个多酚类和4个生物碱类。 1.2潜在活性成分抗RA作用靶点的确定 采用反向分子对接服务器（DRAR-CPI）对初步拟定的潜在活性成分的作用靶点进行拟合，与TCMSP自带靶点合并，得到诃子活性成分靶点186个；从国家生物技术信息中心（NCBI）数据库和Genecards数据库获取RA的靶点共1953个；将RA靶点和诃子药物靶点进行映射，找出47个交集靶点，即为诃子抗RA的作用靶点。经蛋白互作分析，TP53、TNF、IL6、CASP3、ESR1、MAPK14、VEGFA、IL10、PTGS2和BCL2L1是排名前十的关键靶点。TP53、CASP3、VEGFA和BCL2L1主要与细胞增殖、凋亡相关；ESR1主要与激素调节相关；TNF、IL6、MAPK14、IL10和PTGS2主要与炎症相关。 1.3通路的确定与“活性成分-靶点-通路”网络的构建 将诃子抗RA的作用靶点导入DAVID数据库，通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析诃子抗RA的信号通路。借助Cytoscape3.6.1软件构建诃子治疗RA的“活性成分-靶点-通路”网络。 结果共有54条KEGG通路参与诃子抗RA过程中，排在前列的通路主要涉及TNF信号通路、NOD样受体（NODlikereceptor,NLR）信号通路、T细胞受体（Tcellreceptor,TCR）信号通路、核因子κB（Nuclearfactor-κB,NF-κB）信号通路、Toll样受体（Tolllikereceptor,TLR）信号通路、JAK-STAT信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号通路等。各条信号通路形成交汇通路，并最终通过激活NF-κB和MAPK信号通路诱导炎症发生，提示NF-κB和MAPK信号通路在诃子抗RA的信号通路中发挥核心作用。 2.参照网络药理学预测结果对诃子提取物成分的定性定量分析与体外活性研究 2.1提取物的制备 我们选择产地为云南的诃子和炮制诃子（煨诃子），采用超声提取法，以超纯水、50%乙醇水溶液和无水乙醇溶液为溶剂，分别提取得到水提物、50%醇提物和醇提物。 2.2提取物成分的定性分析 由于50%醇提物兼具水提物和醇提物特性，所以，我们选择诃子和炮制诃子的50%醇提物，参照网络药理学的预测结果，采用高分辨质谱仪对其成分进行定性分析。结果诃子和炮制诃子提取物中存在6个多酚类化合物，而4个生物碱类化合物未检出。 2.3提取物成分的定量分析 采用福林酚法和高效液相色谱法（HPLC）对诃子和炮制诃子水提物、50%醇提物和醇提物中总酚含量和各多酚类成分含量进行定量分析。总酚含量测定结果显示炮制诃子总酚含量高于未炮制诃子，其中50%醇提物的总酚含量最高，显著高于水提物和醇提物。HPLC法分析各多酚类成分含量，结果50%醇提物得到的多酚类化合物含量最高，炮制诃子50%醇提物中各化合物含量由高到低依次为诃子宁＞诃黎勒酸＞没食子酸＞柯里拉京＞鞣花酸，其中诃子宁是含量最高的单体化合物。 2.4提取物与单体化合物的活性研究 2.4.1提取物及单体抗氧化活性研究： 采用DPPH法测定诃子和炮制诃子水提物、50%醇提物和醇提物抗氧化能力。结果诃子和炮制诃子的提取物均具有较好的抗氧化活性。炮制诃子无论水提物、50%醇提物还是醇提物，对DPPH自由基清除的活力都高于未炮制诃子。其中炮制诃子50%醇提物对DPPH自由基的清除活力最高，IC50为7.305μg/mL。同等浓度条件下，各多酚类单体化合物抗氧化活性强于炮制诃子50%醇提物。其中没食子酸抗氧化活性最强，鞣花酸次之，其余4种抗氧化活性相当。 2.4.2提取物及其单体抗炎活性研究： 采用IL-1β诱导类风湿性关节炎成纤维细胞MH7A炎症模型研究炮制诃子水提物、50%醇提物和醇提物及各多酚类单体化合物对促炎症因子IL-6和IL-8表达的影响。三种不同溶剂提取物对IL-1β诱导的促炎症因子IL-6和IL-8均抑制作用，其中50%醇提物效果最佳，其次为水提物，最后为醇提物。几个单体酚类化合物中，诃子宁和诃黎勒酸在考察的浓度范围内对IL-6和IL-8均有较强的抑制作用，且随着浓度的增大，抑制作用增强，呈剂量依赖性。 2.5主成分分析明确主要活性成分 采用主成分分析法，以含量、DPPH自由基清除IC50值和低、中、高浓度对IL-6IL-8抑制率为指标对各单体化合物综合评分排序。结果各化合物按分值高低排序依次为诃黎勒酸（1.28），诃子宁（1.02），柯里拉京（-0.26），鞣花酸（-0.35）和没食子酸（-1.70）。诃黎勒酸和诃子宁得分显著高于另外三个化合物，确定为诃子提取物抗关节炎主要活性成分。 3.炮制诃子50%醇提物与主要活性成分诃子宁在胶原诱导关节炎模型大鼠体内的药效学研究 因体内药效学研究需要较大的给药剂量，诃子宁和诃黎勒酸市售供货不足。本研究自提成功制备足够的诃子宁单体，故选择炮制诃子50%醇提物和主要活性成分之一的诃子宁继续进行体内药效学研究。 3.1方法 3.1.1模型大鼠的构建 以经典的胶原诱导关节炎造模，采用牛Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂按1∶1比例混合乳化为滴水不散开的乳剂，通过尾部皮下注射0.2mL乳剂，进行初次免疫诱导；第7天采用同样试剂同样方式进行二次免疫诱导，构建大鼠CIA模型。 3.1.2分组与给药 将42只SD大鼠（雌雄各半，体重160±20g）随机分为7组，每组6只。分别为正常组、CIA模型组、CIA+炮制诃子50%醇提物低剂量组（生药量0.625g/kg，0.5倍临床使用量）、CIA+炮制诃子50%醇提物中剂量组（1.25g/kg，1倍临床使用量）、CIA+炮制诃子50%醇提物高剂量组（2.5g/kg，2倍临床使用量）、CIA+诃子宁组（60mg/kg诃子宁单体，与高剂量组所含诃子宁等量）和CIA+阳性对照药组（甲氨蝶呤MTX2.5mg/kg）。诃子各剂量组和诃子宁组从造模第0天开始每天固定时段灌胃给药，MTX每7天灌胃给药，正常组和模型组每天灌胃给予同等体积的生理盐水，持续给药28天。 3.2结果 3.2.1炮制诃子50%醇提物与诃子宁可降低CIA大鼠发病率和改善症状 模型组大鼠从第10天左右开始发病，发病以后肢肿胀为主，总体发病率显著高于其余组。而给药组虽有发病，但发病率和关节炎指数评分均显著低于模型组。在右后肢足厚度上，正常组平均足厚度为0.61±0.06cm，模型组大鼠随着疾病的发生发展足厚度逐渐增加，到第28天时，平均足厚度为0.85±0.17cm。其余各给药组因疾病程度较轻，足厚度水平也显著低于模型组，差异有统计学意义。 3.2.2炮制诃子50%醇提物与诃子宁可降低促炎症因子的表达 第21天时，模型组大鼠可见明显足肿胀，但测定血中TNF-α水平，发现并未体现出组间差异，几乎测定不到。而到第28天时，可见模型组TNF-α明显升高，显著高于正常组。而炮制诃子提取物各剂量组和诃子宁组均可抑制TNF-α的表达。IL-1β和IL-6结果与TNF-α相似。但诃子宁单体组与含有等量诃子宁的高剂量组相比，高剂量组抑制炎症因子效果更好，差异有统计学意义。 3.2.3炮制诃子50%醇提物与诃子宁对肝肾功能和免疫器官指数无影响 正常组、模型组、炮制诃子50%醇提物低中高三个剂量组、诃子宁组以及MTX组各间胸腺指数和脾脏指数以及肝肾功能指标（肌酐、ALT、AST和ALT/AST）差异无统计学意义。 4.诃子宁抗关节炎作用机制的初步研究 4.1方法 4.1.1模型小鼠的构建 采用牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂按1∶1比例混合乳化为滴水不散开的乳剂，小鼠尾根部皮内注射0.1mL进行初次免疫诱导；在第21天，采用牛Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂按1∶1比例混合乳化为滴水不散开的乳剂，小鼠尾根部皮内注射0.1mL进行二次免疫诱导；通过两次诱导构建小鼠CIA模型。 4.1.2分组与给药 将DBA/1小鼠随机分为5组，每组10只，正常组，CIA模型组，CIA+诃子宁预防给药组，CIA+诃子宁治疗给药组和CIA+阳性对照组（来氟米特）。其中诃子宁预防给药组从二次免疫后开始每天固定时段灌胃给药，连续给药21天；诃子宁治疗给药组和阳性对照组从大多数动物发病时开始给药，剔除未发病小鼠，保证每组8只以上，连续给药21天。正常组和模型组每天灌胃给予同等体积的不含药溶液，持续给药21天。 4.1.3LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型研究诃子宁对MAPK通路和NF-κB通路的调控作用 选择不抑制细胞增殖但能明显抑制炎症因子表达的低、中、高三个浓度梯度（25、50和100μM）诃子宁干预LPS刺激RAW264.7细胞，以激光共聚焦观察诃子宁对MAPK通路p38和NF-κB通路p65的核转录影响；采用核蛋白提取试剂盒分离核蛋白，Westenbloting分别检测核蛋白中MAPK通路p38和NF-κB通路p65表达量的变化。最后选择p38通路抑制剂和NF-κB通路抑制剂进一步验证诃子宁对通路的影响。 4.2结果 4.2.1诃子宁给药可降低CIA小鼠发病率并减缓关节肿胀程度 关节炎模型组从24天左右开始发病，并持续增加，最终90%的小鼠发展为关节炎。而诃子宁预防组在给药期间无关节炎发生，与模型组有显著的统计学差异（p＜0.05）。从关节肿胀严重程度上来看，诃子宁预防给药组的肿胀程度也显著低于CIA模型组。诃子宁治疗组和阳性对照药来氟米特组在给药后均可效缓解关节肿胀。 4.2.2诃子宁能延缓关节滑膜炎症以及软骨与骨损伤 通过Micro-CT扫描重建的3D图发现正常对照组小鼠的骨表面光滑，结构完整。CIA模型组小鼠的趾骨和跖骨连接处，以及跖骨和楔状骨连接处的关节溶蚀明显。而诃子宁以及阳性对照药来氟米特显著延缓了这一损伤。HE染色结果也从病理学角度进一步证实了诃子宁可有效抑制关节炎症，延缓关节破坏。 4.2.3诃子宁可降低促炎症因子的表达 模型组促炎因子IL-6和TNF-α的表达水平显著增高，而诃子宁预防和治疗给药均可降低促炎症因子水平，其中尤以治疗给药效果最佳，与阳性药来氟米特效果相当。 4.2.4诃子宁可抑制p38、JNK、p65和IκBα磷酸化 Westernbloting测定小鼠关节组织蛋白结果显示，与对照组相比，CIA模型组MAPK通路的p38、JNK、ERK的磷酸化和NF-κB的p65与IκBα磷酸化水平显著增高。而诃子宁给药可明显抑制NF-κB的p65与IκBα的磷酸化以及MAPK通路的p38与JNK的磷酸化，但对ERK的磷酸化无影响。 4.2.5诃子宁抑制p38和p65核转录 细胞实验结果显示，LPS可激活RAW264.7细胞，使p38和p65明显核转移，触发炎症反应。而在诃子宁干预后，激光共聚焦下观察到p38和p65核转移明显降低，Westernbloting检测到核蛋白中p38和p65的含量也显著下降。 4.2.6诃子宁与通路抑制剂有协同作用 单独使用诃子宁或p38抑制剂SB203580或NF-κB抑制剂BAY11-7082能抑制LPS诱导的促炎症因子TNF-α和IL-6的表达，而诃子宁联用上述抑制剂具有协同作用，抑制效果进一步加强。 结论： 1.采用网络药理学的方法，预测出诃子抗RA的10个潜在活性成分，通过作用于TP53、TNF-α和IL6等47个靶点，调控NF-κB和MAPK为主的54条信号通路发挥抗RA作用。 2.以超纯水，50%乙醇水溶液和无水乙醇溶液为提取溶剂，系统比较了诃子与炮制诃子提取物在总酚含量、各多酚化合物含量以及抗氧化和抗炎活性的区别。明确炮制诃子在总酚含量、抗氧化和抗炎活性方面均优于未炮制诃子。相较于水提物和醇提物，50%醇提物得到多酚含量最高，抗氧化和抗炎活性最强。 3.首次对炮制诃子50%醇提物体内抗关节炎活性进行研究，结果显示炮制诃子50%醇提物能呈剂量依赖性的延缓CIA大鼠关节炎的发生发展，缓解关节肿胀，降低促炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。 4.对诃子提取物中的5个活性成分没食子酸、柯里拉京、诃子宁、诃黎勒酸和鞣花酸进行较为系统地比较，从含量、DPPH自由基清除IC50值和低、中、高浓度对IL-6与IL-8抑制率等方面综合评估，明确诃黎勒酸和诃子宁为诃子提取物主要活性成分。 5.首次明确诃子宁是诃子提取物中的主要活性成分之一并对其治疗RA的药效学和作用机制进行了较为系统地研究。结果诃子宁对CIA诱导的大鼠和小鼠关节炎模型都有缓解和治疗作用。可通过抑制MAPK和NF-κB相关蛋白的磷酸化与核转录，进一步抑制促炎症因子的表达，缓解关节炎症，发挥治疗关节炎作用。
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