摘要
水环境污染是造成鱼类疾病的重要成因之一，其对水产养殖业造成了严重的影响。氨氮作为重要的水环境胁迫因子，能够导致生物体内有氧代谢异常，活性氧自由基大量积累而引起氧化损伤。铁死亡是铁依赖的以活性氧和脂质过氧化物积累为特征的细胞死亡方式，在哺乳动物多种疾病的发生与发展过程中行使重要的生物学功能。研究表明：发生铁死亡和氨氮应急时巨噬细胞被激活，促使炎症因子的释放、活性氧和脂质过氧化物积累。黄颡鱼是我省乃至我国最重要的经济鱼类之一，高密度集约化养殖模式是造成养殖水环境高浓度氨氮的重要原因。槲皮素作为一种天然的黄酮类物质，具有抑制或减缓铁死亡功效。迄今为止，鱼类疾病中的铁死亡症尚未被阐明，但相关研究表明，鱼类中与铁代谢相关的一些重要基因、代谢产物和信号网络与脊椎动物相似。鉴于此，本研究以氨氮为胁迫源，槲皮素为抑制剂，初步探究氨氮对黄颡鱼头肾巨噬细胞铁死亡相关基因的影响及槲皮素缓解作用，结果可为鱼类抗逆境生理学研究提供一定理论依据。 1、氨氮对黄颡鱼头肾巨噬细胞铁死亡相关基因表达的影响 （1）确定氨氮对黄颡鱼头肾巨噬细胞的半抑制浓度（24hIC50）：试验共设置9个浓度梯度，即对照组（完全培养基，0mg/L）和实验组（0.01mg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L、0.16mg/L、0.32mg/L、0.64mg/L和1.28mg/L），将不同浓度氨氮处理的黄颡鱼头肾巨噬细胞置于28℃、5%CO2培养箱中培养24h。采用MTT法测定氨氮胁迫下黄颡鱼头肾巨噬细胞活力，再使用GraphPad5软件对氨氮浓度以Log对数进行非线性回归分析，拟合浓度效应曲线得出半抑制浓度（24hIC50）。结果显示：24hIC50=0.23mg/L。 （2）氨氮对黄颡鱼头肾巨噬细胞铁死亡相关基因表达的影响：根据24hIC50测定结果，设置4个浓度梯度，即对照组（完全培养基，0mg/L）、0.12mg/L、0.23mg/L和0.46mg/L，胁迫处理时间为24h。采用MTT法检测黄颡鱼头肾巨噬细胞活力情况，DCFH-DA荧光探针检测黄颡鱼头肾巨噬细胞内ROS，GSH检测试剂盒检测黄颡鱼头肾巨噬细胞GSH含量以及采用qPCR检测黄颡鱼头肾巨噬细胞铁死亡相关基因（SystemXc、GPX4、15-LOXb、TFR1、FTL和NCOA4）mRNA。结果显示：①随氨氮浓度的升高，细胞活力呈显著逐渐降低（Plt;0.05）；②与对照组比较，氨氮作用后细胞ROS水平显著性升高（Plt;0.05），即升高至0.23mg/L组后降低，在0.23mg/L组ROS水平达最高。③与对照组比较，不同浓度氨氮可显著降低黄颡鱼头肾巨噬细胞GSH含量（Plt;0.05）。④随氨氮作用浓度的升高，SystemXcmRNA表达水平显著降低（Plt;0.05），GPX4mRNA水平显著升高至0.23mg/L组后降低（Plt;0.05），且在0.23mg/L组中表达最高，于0.46mg/L组mRNA水平开始显著降低（Plt;0.05）。⑤氨氮浓度为0.12mg/L时显著上调15-LOXbmRNA水平（Plt;0.05）。⑥氨氮为0.12mg/L时显著上调FTL和NCOA4mRNA水平（Plt;0.05），在0.23mg/L组显著下调（Plt;0.05），而不同氨氮浓度均下调FTLmRNA水平（Plt;0.05）。 结论：不同浓度氨氮通过先后启动铁死亡的各代谢通路信号，使相关生理指标发生异常，进而促进细胞发生铁死亡。即当低浓度作用时，先升高脂质代谢信号通路中的15-LOXbmRNA水平，催化细胞脂质过氧化，然后升高铁离子代谢信号通路的FTR1mRNA水平，降低FTL和NCOA4mRNA水平，促进胞内过量的铁离子与羟基自由基发生芬顿反应，增加ROS的产生，最后在高浓度组中降低氨基酸代谢信号通路SystemXcmRNA水平，消耗GSH，开始降低GPX4mRNA水平，降低抗氧化系统活性，促进细胞铁死亡的发生。 2、槲皮素对氨氮诱导黄颡鱼头肾巨噬细胞铁死亡相关基因表达的影响 本实验以槲皮素作为铁死亡抑制剂，探究其对氨氮胁迫下巨噬细胞铁死亡相关基因表达的影响。试验共设置4个组，即空白对照组（完全培养基，0mg/L）、氨氮（24hIC50）组、槲皮素（50μmol/L）组和槲皮素（50μmol/L）+氨氮（24hIC50）组，槲皮素预处理巨噬细胞1h后，进行氨氮胁迫处理，处理时间为置于6h、12h、18h和24h，试验过程在5%CO2和28℃培养箱中进行。采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS，以GSH检测盒检测细胞GSH含量以及采用qPCR检测细胞铁死亡相关基因（SystemXc、GPX4、15-LOXb、TFR1和FTL）mRNA水平。结果：（1）在第6h各组活性氧（ROS）无显著性差异（Pgt;0.05），在第12h至第18h时氨氮组ROS水平逐渐升高，与其他三组比较且显著性升高（Plt;0.05），在24h时ROS在各组之间无显著性差异（Pgt;0.05）。（2）在6h、12h、18h和24h氨氮组中GSH含量显著降低（Plt;0.05），并随作用时间呈递减趋势，槲皮素组和槲皮素+氨氮组中GSH均显著升高（Plt;0.05），且随作用时间延长呈递减趋势。（3）与对照组比较，氨氮组SystemXcmRNA表达水平在第6h和12h均显著升高（Plt;0.05）；与氨氮组相比较，第24h时槲皮素+氨氮组SystemXcmRNA表达水平显著高于其它各组（Plt;0.05）。（4）在氨氮组中GPX4mRNA水平在第18h时显著低于其他各组（Plt;0.05），槲皮素干预后GPX4mRNA表达水平显著升高（Plt;0.05）；第24h时槲皮素+氨氮组GPX4mRNA表达水平显著高于对照组和氨氮组（Plt;0.05）。（5）第6h时，槲皮素组15-LOXbmRNA表达水平显著高于其他各组（Plt;0.05）；第12h时，槲皮素组15-LOXbmRNA表达水平显著高于槲皮素+氨氮组（Plt;0.05）；第18h时，槲皮素组15-LOXbmRNA表达水平显著高于氨氮组（Plt;0.05）；第24h时，槲皮素+氨氮组最高，显著高于其他各组（Plt;0.05），同时槲皮素组显著高于对照组（Plt;0.05）。（6）第6h时，氨氮组和槲皮素组TFR1mRNA表达水平显著高于其他两组（Plt;0.05）；第12h时，对照组和槲皮素组最高显著高于其他两组（Plt;0.05），同时氨氮组显著高于槲皮素+氨氮组（Plt;0.05）；第24h时，槲皮素+氨氮组TFR1mRNA表达水平显著高于其他各组（Plt;0.05）；（7）与对照组比较，在氨氮组中FTLmRNA水平从第12h开始升高后至第24h降低，在槲皮素加氨氮组中从第6hFTLmRNA水平升高至12h后降低（Plt;0.05）。 结论：槲皮素通过调控铁死亡代谢信号通路因子mRNA水平，即抑制铁代谢信号通路因子TFR1mRNA过表达，上调FTLmRNA水平，从而控制细胞内铁离子水平过载和ROS的过量产生；升高氨基酸信号通路中SystemXcmRNA水平，促进GSH含量的合成，进而上调GPX4mRNA水平；以及上调脂质代谢通路中15-LOXbmRNA水平，从而提高抗氧化系统活性，改善氨氮诱导黄颡鱼头肾巨噬细胞铁死亡。
NETL