摘要
酯酶是一类既能合成酯类物质又能水解酯键的α/β水解酶，在乳制品烘焙、手性药物研究、洗涤工业、农药除虫剂等方面具有很好的工业利用价值。酶的培养容易受到外界因素的干扰，且游离的酯酶存在稳定性差、存储时间短、重复利用率低等缺点，很难在工业上发挥其真正的价值。因此，在实验室前期获得的重组黑曲霉胞内酯酶（rINANE）的基础上，本研究首先探讨影响毕赤酵母表达产rINANE的外界因素，以获得高活性的rINANE。然后以聚多巴胺（PDA）包裹的磁性四氧化三铁（Fe3O4@PDA）为吸附载体，采用吸附-沉淀-交联的固定化技术对rINANE进行固定化研究。通过对固定化前后酶结构的表征，对酶结构的改变进行说明。最后将固定化酶与游离酶进行酶学性质的比较，进一步说明结构改变给酶带来的性质改变。这些研究可为探讨rINANE的构效关系以及其在工业上大规模使用提供一定的基础。主要研究内容和结果如下： （1）对诱导期间的pH、温度、甲醇添加量、起始OD600、离心转速及诱导时间进行探究。发现诱导时间是影响rINANE酶活力的最主要因素，其次为诱导环境pH和温度。通过均匀设计和规划求解得到最优培养条件为：BMMY培养基pH=6.0，诱导培养温度为25℃，甲醇诱导添加量为1.5%，诱导起始OD600=1.0，诱导后离心转数为4000r/min，诱导120h。此条件下得到的rINANE酶活力为1.925±0.053U/mL，较初始培养条件下的酶活力提升约3倍。 （2）以Fe3O4@PDA为吸附载体，采用吸附-沉淀-交联的固定化技术对rINANE进行固定化，探讨不同固定化条件对rINANE酶活力影响。在Fe3O4@PDA载体与rINANE的固液比为45:1mg/mL，吸附60min，最优沉淀剂丙酮的加入量4mL/mL，果胶加入量3μL/mL，交联1h的条件下，固定化rINANE的酶活回收率和蛋白质负载量分别达到104.40±1.14%和72.72±1.01mg/g。 （3）通过扫描电镜（SEM）、傅里叶红外（FTIR）、X射线衍射（XRD）、ζ-电位以及样品磁强度（VSM）对游离rINANE和固定化过程中的样品进行表征，以探究固定化是否成功以及固定化前后酶结构的变化。SEM结果显示rINANE已成功被固定化，且经吸附-沉淀-交联的固定化技术，酶分子间紧密联系，形成有空穴的网状结构，刚性结构增强，能很好的将底物锁定，提高酶活力。固定化过后，酶的α-螺旋相对含量减少8.73%，β-折叠增加39.74%，再次证实固定化后rINANE的刚性结构增强。XRD结果显示，固定化后载体的晶体结构并未发生改变。固定化rINANE的ζ-电位绝对值为27.42±0.27mV，比rINANE高，表明固定化rINANE溶液的稳定性强于rINANE。固定化rINANE的饱和磁强度为75.193emu/g，具有强磁性，酶结构在磁性作用下保持稳定。 （4）对固定化前后rINANE的酶学性质进行了探究，结果显示固定化酶的最适温度（40℃）比游离酶高出5℃，最适pH也向碱性条件迁移了一个单位，pH为9.0。固定化酶在20℃-45℃处理12h以后，能保持70%以上的酶活，高于游离酶，对pH6.0-10.0范围内仍能保持80%以上的酶活力。对于表面活性剂的加入，游离酶酶活力均得到明显提升，固定化酶酶活力则保持在一个相对稳定的范围内。同样，固定化酶对Cu2+、Zn2+、K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+这六种金属离子以及对有机溶剂的耐受性均高于游离酶。通过对游离酶与固定化酶动力学参数比较发现，固定化酶的米氏常数Km为16.55g/L，高于游离酶（10.86g/L），说明固定化后酶对底物的亲和力降低。在贮藏45d以后，固定化酶仍保持86.6±2.1%的酶活，重复操作8次，还有55.2±1.1%酶活，具有很好的贮藏和操作稳定性。 这些研究为rINANE的基本性质变化提供一定的实验依据，为rINANE的构效分析和固定化rINANE在工业中低成本回收利用奠定基础。
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