摘要
背景 肿瘤转移决定了许多癌症患者的最终结果，特别是胰腺癌。胰腺导管腺癌（PDAC）约占所有胰腺癌的90%，是癌症相关死亡的前五大主要原因之一,患者整体5年生存率小于5%，约85%的PDAC患者在6个月内死于其高转移率。临床上，外科手术是PDAC的主要治疗方法。然而，只有少数PDAC患者可以接受手术，因为大部分患者确诊时已经是晚期，肿瘤已经出现转移。目前，无法接受手术的患者主要接受联合放疗和化疗，吉西他滨是治疗PDAC的主要化疗药物之一。然而，吉西他滨的临床应用不能显著延长PDAC患者的生存时间。因此，开发新的强有力的治疗策略来阻断肿瘤转移或提高吉西他滨的治疗效果对于满足PDAC患者的未满足非常重要的。 新的证据表明，上皮间充质转换（EMT）程序被认为是PDAC从起始到转移进展的主要驱动因素。EMT发生发展过程中，上皮源性肿瘤细胞往往失去上皮细胞的特征，细胞间的粘附逐渐减少，并表达间充质细胞和酶的标记物，导致细胞外基质的分解，最终导致肿瘤的恶性程度和侵袭能力增加。之前的研究表明许多信号通路参与了PDAC的EMT过程，其中就包括Wnt/β-catenin信号，当Wnt/β-catenin信号被激活时，导致位于细胞质内的β-catenin的核易位增加，然后β-catenin作为淋巴增强因子/T细胞的共同激活因子来激活下游基因，如c-Myc。此外，Wnt/β-catenin信号在癌细胞生长增殖中也起着关键作用。在包括胰腺癌在内的多种肿瘤中，Wnt/β-catenin信号的异常激活已被证实。 药物重新定位是传统药物开发的重要策略，其中包括使用现有药物针对不同适应症。药物重新定位不仅可以降低治疗成本和开发时间，而且药物的使用安全性已有临床实践。氯硝柳胺，以抗螺旋体而闻名，已用于治疗绦虫感染约50年。最近的一些研究表明，氯硝柳胺能有效地抑制各种癌症的Wnt/β-catenin信号，包括口腔鳞状细胞癌、结肠癌和乳腺癌。然而，氯硝柳胺在PDAC中的作用尚不清楚。考虑到Wnt/β-catenin信号通路在胰腺癌中的重要作用，我们推测氯硝柳胺可用于治疗PDAC患者。 方法 采用不同浓度的氯硝柳胺分别处理胰腺癌细胞PANC-1和Patu898824h后，胰腺癌细胞的增殖情况采用实时无标记动态细胞分析（RTCA）、CCK-8和集落形成实验来检测，流式细胞术分析检测细胞凋亡情况，采用Transwell侵袭实验和划痕实验检测PANC-1和Patu8988细胞的侵袭和迁移能力变化；细胞免疫荧光染色和Westernblot检测EMT相关蛋白、Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白以及凋亡相关蛋白的表达变化。在此基础上，进一步采用氯硝柳胺（20μM）单独处理或与Wnt/β-catenin通路激活剂香草酸甲酯（Methylvanillate）联合处理胰腺癌PANC-1和Patu8988细胞24h，并设立空白对照组,检测Methylvanillate是否能消除氯硝柳胺对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。通过分子对接找到氯硝柳胺的可能具体靶分子，然后通过基因过表达或者敲除进一步验证其分子机制。最后，采用PANC-1细胞进行裸鼠成瘤实验，通过免疫化学染色和Westernblot等技术检测氯硝柳胺在体内对胰腺癌生长和转移的影响。 结果 在体外，氯硝柳胺剂量依赖性地抑制胰腺癌细胞PANC-1和Patu8988的增殖、迁移和侵袭。此外，高浓度的氯硝柳胺通过线粒体介导的凋亡途径显著诱导胰腺癌细胞凋亡。氯硝柳胺可促进caspase-3的激活，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并增加促凋亡蛋白Bax的表达。在体内，我们发现氯硝柳胺也能抑制胰腺肿瘤的生长并减少转移的发生。深入研究发现，β-catenin可能是氯硝柳胺药物作用靶点。氯硝柳胺通过磷酸化β-catenin，抑制其表达，促进其降解，从而实现对靶基因的调控。应用小分子香草酸甲酯药理性激活β-catenin，或者过表达β-catenin，均可消除氯硝柳胺对胰腺癌细胞的抑制作用。 结论 氯硝柳胺在体内外均能显著抑制胰腺癌细胞增殖和EMT进程，其机制可能是通过靶向抑制胰腺癌中的β-catenin。因此，氯硝柳胺在胰腺癌的治疗中可以作为一个新的治疗策略。
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