摘要
目的： 纳米氧化锌（Zincoxidenanoparticles,ZnONPs）是一种使用广泛的金属纳米材料，职业暴露、接触暴露后，可能具有细胞和组织毒性。既往人群数据和实验动物研究提示，纳米级颗粒物吸入可以穿透肺泡上皮细胞直接入血继而引发/加重心血管疾病。血管内皮是ZnONPs入血后的直接作用部位，因此深入解析ZnONPs造成血管内皮损伤的分子机制，具有重要的科学意义。本研究拟在细胞水平和动物水平去阐释ZnONPs通过铁自噬依赖的铁死亡造成血管内皮损伤的机制。 方法： 1、通过在两种血管内皮细胞HUVEC和EA.hy926上，使用显微镜观察、MTS、FACS等手段检测ZnONPs可否造成血管内皮细胞死亡；使用PGSK和LIP的方法检测细胞内铁离子浓度，使用MDA和C11-BODIPY染料检测脂质过氧化水平，使用QPCR和WB的方法检测铁死亡的关键基因和蛋白的表达情况，以明确ZnONPs可否造成血管内皮细胞死亡；进一步使用铁死亡抑制剂证明铁死亡是否是重要的死亡方式。 2、进一步通过TEM、免疫荧光、WB等手段，联合药物干预（CQ、BafA1、3-MA）和基因干预（ATG5KO）等手段，检测ZnONPs是否引起自噬； 同时通过检测FTH1是否依赖于NCOA4介导的自噬降解，以及使用NCOA4敲低细胞株检测起能否缓解铁自噬铁死亡。 3、通过WB的方法检测AMPK、MTOR及其下游蛋白的表达水平，明确哪条通路调控了ZnONPs引发的自噬。继而通过siRNA介导的基因敲低进一步确认关键的自噬激活调控信号。 通过检测线粒体膜电位、形态以及氧化应激，明确ZnONPs是否造成线粒体损伤和线粒体来源的ROS（mtROS）产生；继而通过ROS清除剂MitoTEMPOL和NAC明确mtROS是否是铁自噬和铁死亡激活的上游机制。 4、构建气管暴露ZnONPs引发小鼠内皮损伤的模型，通过综合使用透射电镜检测腹主动脉的超微病理改变、QPCR检测炎症相关因子、测定MDA含量、使用WB检测铁自噬和铁死亡的相关蛋白的表达等手段，尝试证明ZnONPs是否造成血管损伤和铁自噬相关的铁死亡。继而通过使用Fer-1，观察抑制铁死亡是否能否缓解ZnONPs导致的血管内皮损伤。 结果： 1、纳米氧化锌可引发血管内皮细胞铁死亡：ZnONPs的暴露可以在血管内皮细胞HUVEC和EA.hy926中导致剂量和时间依赖的细胞内铁水平升高、脂质过氧化增加和细胞死亡。脂质活性氧(ROS)清除剂Fer-1和DFP均可减轻ZnONPs诱导的细胞死亡，提示ZnONPs可能造 成血管内皮细胞铁死亡。 2、纳米氧化锌可通过激活铁自噬的途径促进血管内皮细胞铁死亡：ZnONPs有在血管内皮细胞中引起自噬激活，通过药物干预和基因干预抑制自噬可以很好的缓解ZnONPs导致的血管内皮细胞死亡；同时，我们发现ZnONPs可导致储铁蛋白FTH1依赖于于NCOA4介导的自噬进行降解，从而增加细胞内铁离子并导致铁死亡。NCOA4的敲低可以导致FTH1的降解受阻并缓解ZnONPs造成的细胞铁死亡。 3、mtROS-AMPK-ULK1信号轴参与了纳米氧化锌导致的铁自噬和铁死亡：ZnONPs释放的锌离子导致线粒体的损伤和mtROS的升高，进而通过活化AMPK-ULK1激活铁自噬，铁离子升高和铁死亡。通过MitoTEMPOL和NAC消除mtROS、或者敲低AMPK和ULK1基因，均可以显著降低ZnONPs导致的细胞内脂质过氧化和铁死亡。 4、纳米氧化锌气管暴露可通过铁自噬依赖的途径引发小鼠血管内皮损伤：ZnONPs气管暴露可造成血管内皮的病理性改变和炎症因子升高，并伴随着LC3B-II、p-AMPK、p-ULK1的升高以及FTH1的降低，提示铁自噬的激活。同时，铁死亡负调控蛋白GPX4和SLC7A11下降、而铁死亡标志性基因Ptgs2的表达增加、而且MDA含量增加，提示ZnONPs的气管暴露导致了血管内皮的铁死亡。通过Fer-1干预，可以很好的缓解ZnONPs气管暴露导致的血管内皮损伤。 结论： 通过细胞和动物水平的实验我们证实ZnONPs可通过NCOA4介导的铁自噬促进铁死亡的发生和引发血管内皮损伤。mtROS激活的 AMPK-ULK1通路是ZnONPs引发铁自噬和铁死亡和关键调控通路。我们提出铁自噬引发的铁死亡是纳米材料导致血管内皮损伤的新机制，为深入理解纳米材料的生物学效应提供了新观点。
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