摘要
目的：胚胎植入是发育至具备着床功能的囊胚种植到容受性良好的子宫内膜的过程，成功的胚胎植入是正常妊娠的先决条件。植入失败将导致妊娠异常，其中约三分之一的植入失败由囊胚“质量不佳”引起，三分之二源于子宫内膜容受性的建立异常。然而，目前关于子宫内膜容受性这一复杂精细的动态过程，其分子机制仍不明晰。在前期研究发现小鼠围植入期子宫内膜中mT0RC2成员Rictor存在时空表达特异性的基础上，本研究旨在深入探究Rictor对围植入期子宫内膜功能的调控作用及分子机制，以期补充完善子宫内膜容受性的分子调控网络，并为不孕症提供新的临床诊疗思路。 方法： 1.子宫内膜条件性敲除Rictor基因小鼠的建立及模型验证 (1)借助Cre-Loxp重组酶系统特异性敲除小鼠子宫内膜目的基因Rictor:购买PR-Cre工具小鼠（C57BL/6J)，再将其与同品系携带RiCtorf/f的小鼠合笼繁殖，经过几代繁殖后，通过鼠尾DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定实验，筛选出基因型为PRcre+/-RiCtorf/f的雌性小鼠，即为实验所需要的子宫内膜条件性敲除Rictor小鼠，记为Rictor-，同时基因型为PRcre-ARictoi^的小鼠作为对照组，记为Rictor'' (2)小鼠模型的验证:通过免疫组织化学和蛋白免疫印迹检测Rictor—小鼠与Rictorf/f小鼠子宫内膜Rictor的蛋白表达。 2.小鼠正常妊娠模型的建立及取材 取8周龄性成熟Rictorf/f与Rictor-小鼠（体重20-30g)，与同品系野生型的性成熟雄鼠以2:1比例于17:30-18:00合笼交配，次日早晨08:00-08:30查见阴栓者记为妊娠第一天（D1)，妊娠天数以此类推。分别取两组D4、D4.5、D5小鼠血液、卵巢以及子宫内膜组织。 3.条件性敲除子宫内膜Rictor对小鼠卵巢形态及功能的影响 (1)对各组小鼠卵巢进行湿重秤量和统计。 (2)用q-PCR检测各组卵巢中Rictor的转录水平；通过IHC检测各组卵巢组织中Rictor的蛋白表达水平；用ELISA检测各组小鼠血清雌二醇和孕酮水平并进行统计学分析。 4.条件性敲除子宫内膜Rictor对小鼠子宫形态及胚胎植入的影响 (1)各组小鼠分别于囊胚进入宫腔时期即妊娠D4、子宫内膜形态转化时期即D4.5和胚胎植入期即D5收集子宫组织，统计小鼠子宫湿重。 (2)于各组妊娠D5小鼠尾静脉注射O.lmL台盼蓝溶液（0.4%)对胚胎植入点进行观察，统计小鼠子宫内膜胚胎植入位点数量。若无台盼蓝显示的着床点，则使用生理盐水冲胚后显微镜下统计囊胚数量。 5.条件性敲除子宫内膜Rictor对小鼠子宫内膜容受性的影响 (1)通过IHC检测细胞增殖标志物Ki67和容受性标志物Lif在两组小鼠D4、D4.5子宫内膜的表达情况。 (2)通过IHC检测D4、D4.5小鼠子宫内膜组织中雌激素受体ERoc/pERoc和孕激素受体PR的蛋白表达；利用q-PCR检测D4小鼠子宫内膜组织中雌孕激素下游信号分子Mucl,Ltf,Lgf,Hsdllb2,Areg,Ihh和Hand2的mRNA水平。 6.小鼠子宫内膜腔上皮细胞重塑及相关信号通路检测 (1)透射电镜观察D4.5小鼠子宫内膜上皮细胞微绒毛形态和细胞间紧密连接。 (2)IHC检测CK8在D4、D4.5小鼠子宫内膜的表达以观察腔上皮细胞形态；IHC检测细胞间粘附分子E-Cadherin在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达；IF检测侧面紧密连接蛋白Occludin,Claudin-7和上皮顶端连接分子Par3在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达，观察细胞间紧密连接状态。 C3；)TUNEL检测D4、D4.5小鼠子宫内膜细胞凋亡情况；IHC检测Foxol在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达。 (4)IHC检测微管解聚相关调节蛋白TTBK1在D4、D4.5小鼠子宫内膜的蛋白表达。 (5)WB检测D4、D4.5和D5小鼠子宫内膜组织中Rictor及上皮重塑相关信号通路蛋白pAKT/AKT、Rac-1、ERM/pERM、PAKl/pPAKl的蛋白表达水平，p-actin作为内参。 7.小鼠子宫内膜腔上皮细胞Na+通道功能及相关信号通路检测 (1)分离Rictorf/f以及Rictor—小鼠原代子宫内膜上皮细胞进行培养，利用IF检测上皮细胞标志性分子角蛋白来鉴定细胞纯度，利用胰酶处理细胞模拟囊胚刺激信号。 (2)借助荧光染料DiBAC(：4：)3指示细胞膜电位的变化，激光共聚焦显微镜采集图像。 (3)WB检测两组小鼠原代子宫内膜上皮细胞中Na+通道(ENaCoc)及相关信号通路蛋白Sgkl/pSgkl的蛋白表达。 8.Rictor对人子宫内膜容受性的调控及相关机制检测 通过宫腔镜手术取正常对照组以及不孕患者的分泌期子宫内膜标本；IHC检测两组人子宫内膜组织中Rictor的蛋白表达。 (1)Rictor在人子宫内膜腔上皮细胞重塑中的作用及相关信号通路检测 IF检测人子宫内膜侧面紧密连接蛋白Occludin、Claudin-7的表达，显微镜下观察细胞形态以及紧密连接状态；培养人子宫内膜癌细胞系Ishikawa(容受态子宫内膜上皮细胞），经转染shRNA-Rictor下调Rictor表达后，WB检测Rictor、pAKT/AKT、Rac-1、ERM/pERM,PAKl/pPAKl以及P-actin的蛋白表达水平。 (2)Rictor对人子宫内膜腔上皮Na+通道功能的调控及相关信号通路检测 Ishikawa细胞经转染shRNA-Rictor下调Rictor表达后，利用胰酶处理模拟囊胚刺激信号，借助荧光染料DiBAC(：4：)3指示细胞膜电位的变化，激光共聚焦显微镜采集图像；WB检测Ishikawa细胞转染shRNA-Rictor前后，ENaCa、Sgkl/pSgkl的蛋白表达水平。 9.利用转录组测序及生物信息学分析深入探讨Rictor调控小鼠容受期子宫内膜功能的机制 (1)收集Rictoff以及Rictor-小鼠妊娠D4新鲜子宫内膜组织进行转录组测序； (2)对测序数据进行差异基因的统计分析，绘制韦恩图；对差异基因进行功能聚类（GO)分析以及KEGG信号通路分析；深入挖掘与子宫内膜容受性建立密切相关的上皮细胞分子事件（细胞增殖、细胞凋亡和细胞骨架）相关差异基因。 结果： 1.子宫内膜条件性缺失Rictor基因的小鼠模型建立成功 通过对小鼠鼠尾DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定实验，筛选出Rictorf/1nRictor-小鼠。IHC和WB结果均显示：与对照组小鼠相比，Rictor在Rictor-小鼠D4、D4.5、D5子宫内膜组织中的表达水平明显降低。 2.子宫内膜条件性缺失Rictor基因对小鼠卵巢功能的影响 (1)q-PCR结果显示：各组卵巢组织中Rictor的转录水平无显著差异；IHC结果显示：Rictor蛋白广泛表达于各组小鼠卵巢组织的颗粒细胞及黄体细胞质，Rictor-小鼠卵巢颗粒细胞中Rictor的表达与对照小鼠相比水平有所下降。 (2)卵巢湿重结果显示:Rictor—小鼠D4卵巢湿重减小，但D4.5、D5无显者差异。 (3)ELISA结果显示：Rictor-小鼠D4血清雌二醇和孕酮激素水平较Rictorf/f均有所上调。 3.Rictor在子宫内膜表达缺失导致小鼠胚胎植入失败 (1)Rictor-小鼠D5子宫在尾静脉注射台盼蓝后，肉眼观察无着床点，与Rictor^"小鼠相比有统计学意义。 (2)D5未见着床点的小鼠子宫用生理盐水冲洗宫腔后，显微镜下观察冲洗液可看到一定数量的正常囊胚。 4.子宫内膜Rictor基因表达缺失导致子宫内膜容受性受损 (l)IHC结果显示：Ki67表达于Rictorf/Mh^D4，D4.5子宫内膜基质细胞核，而在Rictor-小鼠子宫内膜腔上皮细胞核呈强阳性，而基质细胞Ki67阳性细胞减少；Lif高表达于对照组小鼠子宫内膜上皮细胞质，而在Rictor-小鼠子宫内膜中表达显著降低。 (2)对雌孕激素信号通路的检测结果显示：ER广泛表达于两组小鼠D4和D4.5子宫内膜组织的上皮细胞和基质细胞的细胞质与细胞核，p-ER高表达于RictoP小鼠子宫内膜基质细胞核，ER和p-ER在Rictor-小鼠子宫内膜腔上皮细胞中呈强阳性，基质细胞表达减弱；PR广泛表达于两组小鼠D4和D4.5子宫内膜组织基质细胞的细胞质与细胞核，且Rictor-小鼠子宫内膜基质细胞中蛋白表达水平显著降低；q-PCR结果显示：与Rictoff小鼠相比，Rictor-小鼠妊娠D4子宫内膜组织中雌激素在上皮细胞中的下游靶基因Mucl、Ltf表达显著增加，在基质细胞中的下游靶基因Lgf、Hsdllb2表达减少；孕激素在上皮细胞的下游靶基因Areg、Ihh和基质细胞的下游靶基因Hand2均显著下调。 5.Rictor通过pAKT/Rac-1调控小鼠子宫内膜上皮细胞重塑 (1)TEM结果显示：Rictoff小鼠子宫内膜腔上皮细胞可见变短的微绒毛，部分细胞间紧密连接打开；而Rictor-小鼠子宫内膜腔上皮细胞的微绒毛消失，核周间隙增宽，出现空泡样细胞。 (2)IHC结果显示：CK8表达于两组小鼠子宫内膜腔上皮细胞的细胞质，Rictorf/f小鼠于D4时子宫内膜腔上皮呈单层立方状，而Rictor^小鼠子宫内膜腔上皮细胞呈现多层且仍为柱状，部分出现空泡样细胞；E-Cadherin聚集在Rictoff小鼠腔上皮细胞顶端，侦愐粘附分子表达减少，而Rictor-小鼠腔上皮细胞侧面粘附分子仍呈强阳性。 (3)IF结果显示：紧密连接蛋白Occludin,Claudin-7主要表达于两组小鼠腔上皮和腺上皮的细胞质以及细胞膜，两种蛋白在Rictor-小鼠D4、D4.5子宫内膜腔上皮表达增加，多聚集在细胞膜近腔侧，Par3主要表达于两组小鼠腔上皮细胞的细胞质及细胞膜，Rictor-小鼠D4,D4.5子宫内膜腔上皮表达增加，且细胞与细胞之间的膜表达增加更为明显。 (4)IHC检测TTBK1发现其主要定位在Rictoff小鼠腔上皮和腺上皮细胞质中，在Rictor-小鼠D4、D4.5子宫内膜上皮细胞中的表达明显下调。 (5)TUNEL检测结果发现Rictor-小鼠腔上皮细胞凋亡增加;IHC结果显示:Foxol广泛表达于R1Ctorf/f小鼠子宫内膜腔上皮的细胞质，而在Rictor-小鼠腔上皮细胞核的定位显著增加。 (6)WB检测结果显示：与Rictorf/Mh^相比，Rictor-小鼠D4、D4.5、D5子宫内膜组织中pAKT,Rac-1表达下调。 6.Rictor通过Sgkl/pSgkl调控小鼠子宫内膜上皮Na+通道功能 (1)上皮细胞膜电位检测发现，Rictoff小鼠原代上皮细胞在胰酶处理模拟囊胚刺激信号后，膜电位信号增强，而Rictor-小鼠的上皮细胞在胰酶处理后，膜电位信号无显著变化。 (2)WB检测显示，Rictor-小鼠子宫内膜中pSgkl表达下调，ENaCoc表达无显著差异。 7.Rictor参与调控人子宫内膜容受性 (1)IHC检测显示:Rictor主要定位于人子宫内膜上皮和基质细胞质中，在不孕患者子宫内膜中Rictor的表达明显低于正常对照组。 (2)IF检测显示：紧密连接蛋白Occludin,Claudin-7主要定位在人子宫内膜腔上皮和腺上皮胞膜和胞质。在不孕患者子宫内膜中表达升高，特别是腔上皮细胞近宫腔侧；WB检测Ishikawa细胞转染shRNA-Rictor后，pAKT、Rac-1,pERM、pPAKl表达较对照组显著下调。 (3)上皮细胞膜电位检测发现，shRNA-Rictor转染Ishikawa细胞后用胰酶处理模拟囊胚刺激信号，膜电位信号较对照组变化不明显;WB检测Ishikawa细胞转染shRNA-Rictor后，ENaCa、pSgkl的蛋白表达较对照组下调。 8.RNA-Secquence测序数据及分析 (1)对D4Rictoff以及Rictor-小鼠子宫内膜进行转录组测序，结果发现在容受性建立时期，与Rictorf/f小鼠相比，Rictor-小鼠子宫内膜组织中表达发生显著变化（logxRictoi^/Rictoi^S])的差异基因1677个，其中上调883个，下调794个。 (2)GO分类和KEGG信号通路分析结果显示：与细胞增殖紧密相关的差异基因有36个，其中上调25个，下调11个；与细胞凋亡紧密相关的差异基因有12个，其中上调11个，下调1个；与细胞骨架紧密相关的差异基因有12个，其中上调7个，下调5个。 结论： (1)借助Cre-Loxp重组酶系统可特异性敲除小鼠子宫内膜目的基因Rictor的表达，而子宫内膜条件性缺失Rictor将导致小鼠子宫内膜雌孕激素信号通路失衡、容受性受损，进而导致不孕。 (2)Rictor通过调控子宫内膜腔上皮细胞转化参与容受性建立，其中pAKT/Rac-1介导的上皮细胞极性重塑和Sgkl/pSgkl介导的腔上皮细胞Na+通道功能变化可能是Rictor调控子宫内膜容受性的重要机制。 (3)Rictor在不孕症患者子宫内膜上皮细胞中表达显著下调，且Rictor在人子宫内膜上皮细胞极性重塑以及Na+通道功能的调控中发挥重要作用，提示其可作为不孕症的潜在诊治靶标。 (4)测序及生物信息学分析提示Rictor可能通过调控子宫内膜腔上皮细胞的增殖、凋亡或细胞骨架稳定性参与调控子宫内膜容受性的建立。
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