摘要
天然衍生化合物对寻找新的临床药物极其重要，尤其是抗癌药物[1]。半数以上的癌症化疗药物是天然化合物及其衍生物[2,3]。吴茱萸碱，由吴茱萸中分离得到，是一种具有喹唑啉骨架的著名生物碱。吴茱萸碱传统上用于治疗头痛、闭经、产后出血和胃肠道疾病。吴茱萸碱的生物活性已被广泛研究，包括抗肥胖[4,5]、抗炎[6,7]、抗动脉粥样硬化[8]、神经保护[9,10]、抗胃肠动力[11]和抗增殖作用[12]。其中，吴茱萸碱具有的多分子靶向抗增殖活性最引人关注。 在包括肺癌[13,14]、肝癌[15]、结肠癌[16]、乳腺癌[17]、卵巢癌[18]、宫颈癌[19]等多种癌症中，吴茱萸碱均有良好的抗肿瘤活性。而在白血病中，EVO能通过诱导细胞凋亡[20]、阻滞细胞周期进程等方式[21]，发挥抗肿瘤作用。实际上，在EVO抑制多种癌症的过程中，AKT发挥着极为重要的作用[22-25]。AKT参与很多重要的生物学过程的调控，其通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关[26]。因此，进一步阐明EVO调控AKT活性的具体机制，对EVO的临床抗肿瘤应用有着重要意义。 多种生长因子、细胞因子可以通过同源受体络氨酸激酶、细胞因子受体以及脂质激酶PI3K的活化来激活AKT[27]。PI3K将PIP2转化为PIP3。PIP3能够与AKT的PH结构域结合，随后转移至细胞膜上，被PDK1在Thr308磷酸化，PDK2再对其Ser473磷酸化，才能完全活化AKT[28]。此外，也有报道称CDK2能使AKT在Ser477和Thr479发生磷酸化，并导致AKT进入细胞核发挥功能[29]。总之，对于AKT来说，其酶活性主要受Thr308以及Ser473所调节。 Tribbles假激酶蛋白家族由TRIB1、TRIB2和TRIB2构成，是真核生物假酶中的重要组成成员[30]。TRIBs作为信号传导介质和支架蛋白，可导致蛋白稳定性和活性发生变化，从而影响多种肿瘤细胞过程，如增殖、分化、细胞周期和细胞凋亡[31-35]。TRIB1可以和肿瘤抑制蛋白C/EBPα的泛素连接酶COP1直接结合，促进C/EBPα的降解，加速了急性髓性白血病的发生发展[36]。TRIB2也是一种致癌蛋白，其转录受到Wnt/TCF所调控，能抑制FOXO蛋白活性，影响黑色素瘤和白血病的发生及发展[37]。更重要的是，TRIB2被报道能与AKT形成蛋白复合物而促进其Ser473的高度磷酸化，最终诱导肿瘤细胞耐药，且TRIB2的表达水平与患者的预后相关[38]。 众多研究报道EVO可通过抑制PI3K/AKT通路诱导肿瘤细胞的凋亡，但其在白血病细胞中是否可能通过抑制AKT通路诱导细胞的凋亡，以及TRIB2在EVO抑制AKT信号通路中的具体作用尚不明确。因此，本研究将在体内外探究EVO对白血病细胞凋亡的影响以及AKT发挥的具体作用，并初步剖析TRIB2在EVO调控AKT活性中扮演的角色。 本研究第一部分以人白血病（Leukemia）细胞株K562为研究对象，在裸鼠皮下成瘤模型中检测EVO对于K562细胞生长的影响，并在体外观察EVO对于K562细胞凋亡的影响；第二部分深入探究EVO诱导K562细胞凋亡的潜在机制。 第一部分：在BALB/c裸鼠的皮下注射K562细胞，建立裸鼠瘤体生长模型，使用不同剂量的EVO进行灌胃处理，记录小鼠体重、瘤体体积，实验结束后，测量瘤体重量，使用Tunel染色法检测瘤体细胞凋亡水平。在体外实验中，使用CCK-8法检测不同浓度EVO对K562细胞增殖的影响，使用流式细胞术法检测EVO对K562细胞凋亡的影响。 第二部分：使用Western-blot法检测EVO对于K562细胞中TRIB2、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65、Caspase3、Bcl-2等蛋白的表达；运用RT-PCR方法检测TRIB2的mRNA表达；以EVO作用于AKT激活剂SC79预处理后的K562细胞，流式细胞术检测细胞凋亡，Westernblot检测TRIB2、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65、Caspase3、Bcl-2等蛋白的表达。以siRNA抑制TRIB2转录因子TCF4的表达后，Westernblot检测TRIB2、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65等蛋白的表达，流式细胞术检测细胞凋亡。以EVO作用于Wnt激活剂SKL2001预处理后的K562细胞，Westernblot检测TRIB2、AKT、p-AKT的表达。 结果 第一部分 1．小鼠体重记录显示：对照组与低剂量EVO组（10mg/Kg）、高剂量EVO组（20mg/Kg）三组之间，小鼠体重无统计学差异； 2．瘤体体积记录显示：EVO组的瘤体体积明显小于对照组，且高剂量的EVO组的瘤体体积更小； 3．瘤体重量记录显示：低剂量与高剂量组的瘤体重量均显著低于对照组； 4.Tunel染色结果显示：低剂量与高剂量的EVO均能在裸鼠体内诱导K562细胞发生凋亡； 5.CCK-8的检测结果显示：EVO能显著地抑制K562细胞生长，且呈浓度依赖性。 6.流式细胞术检测显示：EVO能诱导K562细胞发生凋亡，且呈浓度依赖性。 第二部分 1.WesternBlot结果显示：EVO能明显地抑制K562细胞中的Trib2、p-AKT、p-IκBα、p-NF-κBp65、Bcl-2的表达，但不影响AKT、IκBα、NF-κBp65的表达，Casepase3的水平显著上调。 2.RT-PCR的结果显示：EVO能显著地抑制TRIB2的mRNA表达，呈浓度依赖性； 3.经AKT激活剂SC79预处理后的流式细胞术结果显示：SC79能显著地抑制EVO诱导的K562细胞凋亡。 4.经AKT激活剂SC79预处理后的WesternBlot结果显示：单独使用EVO能显著抑制TRIB2/AKT信号通路，而在EVO联合SC79组中，TRIB2的表达没有变化，但EVO对于AKT信号通路的抑制作用显著降低。 5.以siRNA抑制TRIB2转录因子TCF4的表达后的流式细胞术结果显示：EVO组、siTCF4组以及联合组的K562细胞凋亡水平均显著高于对照组。 6.以siRNA抑制TRIB2转录因子TCF4的表达后的WesternBlot结果显示：尽管EVO组不能抑制TCF4的蛋白表达，但EVO组、siTCF4组以及联合组均能有效地抑制TRIB2/AKT信号通路。 7.经Wnt激活剂SKL2001预处理后的WesternBlot结果显示：SKL2001能显著地上调TRIB2的表达并活化AKT信号通路，而EVO能抑制SKL2001上调TRIB2的表达以及AKT信号通路的活化。 结论 1．在裸鼠成瘤实验中，不同剂量的EVO能在不影响小鼠体重的情况下，抑制瘤体体积的增长和瘤体重量的增加，并上调细胞凋亡水平；在体外实验中，EVO能显著抑制K562细胞的生长并诱导其凋亡。 2．EVO能通过抑制TRIB2/AKT信号通路，下调NF-κBp65的转录活性，从而诱导细胞发生凋亡；AKT的激活剂SC79能削弱EVO对AKT信号通路的抑制作用，并逆转其诱导K562细胞凋亡的能力；而抑制TRIB2的转录因子TCF4的表达，同样能抑制AKT信号通路并诱导K562细胞凋亡；EVO同样可以抑制由Wnt激活剂SKL2001所诱导的TRIB2的表达上调、AKT活化。
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