摘要
目的：研究肺炎链球菌S.pn毒力蛋白自溶素LytA是否通过改变S.pn-DNA在宿主巨噬细胞胞质中的累积而影响巨噬细胞ISG化，进一步调节巨噬细胞的吞噬功能。 背景：肺炎链球菌lytA基因编码自溶酶LytA，该蛋白作用于细菌细胞壁肽聚糖使其水解，使稳定生长期的S.pn发生自我溶解死亡，并释放出多种胞内容物如Ply、S.pn-DNA等。研究表明，宿主细胞质中异常累积的DNA可通过DAI/STING/IRF3信号通路介导IFN-Ⅰ及ISGs表达上调。其中表达上调最显著的ISG15是一种类泛素蛋白，已被证明在宿主对抗病毒、细菌和真菌感染中均具有重要作用。但是ISG15在S.pn感染过程中的调节作用，以及LytA对宿主细胞ISG化应答的影响尚不清楚。前期研究提示S.pn表达LytA缺失显著抑制S.pn-DNA的释放，后者可上调ISG15表达，故我们推测S.pn自溶素LytA可能会通过改变S.pn-DNA在宿主细胞质中的异常累积而影响IFN-Ⅰ免疫应答及其下游ISG15的表达，从而调控巨噬细胞对S.pn的吞噬功能。 主要研究方法： 1、培养RAW264.7细胞、PEMs细胞、A549细胞和MEF细胞，分为NC组、Lipo2000处理组、S.pnD39感染组以及S.pn-DNA刺激组，通过qPCR和WB检测S.pn及S.pn-DNA是否能够诱导宿主细胞ISG15及ISG化水平上调。 2、培养RAW264.7细胞，分为NC组、S.pnD39感染组以及S.pnD39ΔlytA感染组，通过qPCR和WB检测RAW264.7细胞ISG15和ISG化蛋白质的表达水平，来验证S.pn自溶素LytA影响巨噬细胞ISG化。 3、培养RAW264.7巨噬细胞，分为NC组、S.pnD39感染组、S.pnD39ΔlytA感染组以及rLytA+S.pnD39ΔlytA刺激组，经免疫荧光染色后在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞质中异常DNA的累积情况，qPCR技术定量细胞质中S.pn基因组保守序列16SrDNA和gyrB的拷贝数，来验证S.pn自溶素LytA影响S.pn-DNA在巨噬细胞胞质中的累积。 4、培养RAW264.7巨噬细胞，分为NC组、S.pnD39感染组、S.pnD39ΔlytA感染组以及rLytA+S.pnD39ΔlytA刺激组，通过吞噬杀伤实验检测巨噬细胞的功能，同时以qPCR技术测量炎性因子TNF-α和IL-1β的表达水平。 主要研究结果： 1、与NC组和Lipo2000处理组相比，S.pnD39全菌和S.pn-DNA刺激可诱导RAW264.7细胞、PEMs细胞、A549细胞和MEF细胞中ISG15以及ISG化水平显著升高，且ISG15的表达水平对IFN-β呈剂量依赖性。 2、与NC组和S.pnD39感染组相比，S.pnD39ΔlytA感染组RAW264.7细胞中ISG15以及ISG化蛋白质表达水平显著增高。 3、S.pnD39ΔlytA感染组RAW264.7细胞胞质中S.pn-DNA异常累积较S.pnD39组显著增多，而当给予S.pnD39ΔlytA组RAW264.7细胞补充外源性rLytA蛋白则可抑制这种异常累积。 4、与S.pnD39感染组相比，S.pnD39ΔlytA感染组RAW264.7细胞对细菌的吞噬能力增强而杀伤率降低，而补充外源性rLytA蛋白可抑制S.pnD39ΔlytA组RAW264.7细胞对细菌的吞噬杀伤功能。此外S.pnD39ΔlytA组RAW264.7细胞中炎性因子TNF-α和IL-1β的表达水平较S.pnD39感染组显著升高。 结论： 本研究首次证实肺炎链球菌S.pn重要的毒力蛋白自溶素LytA通过诱导S.pn自溶增加而减少巨噬细胞对S.pn的吞噬及细胞质内S.pn-DNA的异常累积，从而降低S.pn-DNA诱导ISG化应答水平；同时阐明S.pn表达LytA缺陷进一步显著上调由S.pn感染诱导的ISG15表达，进而导致炎性因子TNF-α和IL-1β的高表达，上调调控巨噬细胞对S.pnD39ΔlytA的吞噬功能，有助于促进宿主清除S.pnD39ΔlytA。这将有利于深入认识细菌自溶、细菌DNA释放等过程参与机体免疫应答的调控机制，为防治肺炎链球菌感染性疾病提供新的实验依据。
NETL