摘要
研究背景： 类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一种免疫介导的炎症性疾病，其以滑膜炎症为主要病理特征，可导致软骨破坏甚至关节功能丧失。研究表明巨噬细胞(Macrophages)和成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-likesynoviocytes,FLS)是滑膜炎症及软骨破坏的主要细胞，尤其是活化的巨噬细胞通过分泌肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和B细胞激活因子(B-cellactivationfactor,BAFF)等细胞因子促进炎症进程和组织损伤。而巨噬细胞中非活性菱形蛋白2(inactiverhomboidprotein2,iRhom2)可促进TNF-α的分泌，同时TNF-α可诱导BAFF的表达。TNF-α和BAFF抑制剂能改善RA的炎症程度，延缓疾病的进展，因此，抑制iRhom2及其介导TNF-α和BAFF的产生有望缓解RA的炎症进程。 地塞米松(Dexamethasone,Dex)具有较强的抗炎、抗风湿和免疫抑制作用，可快速缓解RA患者关节肿胀和疼痛，减少骨侵蚀并降低TNF-α的水平而用于RA的治疗，且Dex可抑制RA巨噬细胞中TNF-α和BAFF的表达。但长期高剂量的Dex治疗会导致全身的毒副作用，如股骨头缺血性坏死、骨质疏松及骨折等。因此，若能将Dex有效地靶向递送至RA巨噬细胞内并减少给药次数和剂量，无疑能有效降低其副作用，从而提高其在RA中的应用。近年研究表明纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)能够有效地将药物传递至病变部位，是一种可靠、有效，可应用于临床的策略。而RA巨噬细胞中叶酸受体(Folatereceptor,FR)的高表达和活性氧水平(Reactiveoxygenspecies,ROS)的显著升高为NPs的靶向输送提供了有益条件。 基于以上分析，本课题制备了叶酸(Folateacid,FA)修饰的ROS响应性材料(Oxi-αCD)，并通过纳米沉淀自组装将Dex包裹并组装成纳米颗粒，探讨其是否能靶向关节炎症部位活化的巨噬细胞以及其在RA治疗中的作用及机制。 研究目的： 探讨ROS响应负载Dex的NPs对RA的治疗作用及分子机制。 研究方法： 1.通过化学反应合成ROS响应性材料Oxi-αCD和Cy5标记的Oxi-αCD，并对材料进行核磁共振氢谱表征。 2.通过纳米沉淀法制备ROS响应的NPs，并对所制备的NPs进行透射电镜、纳米粒径、纳米颗粒分散性指数、Zeta电位表征以及冻干法检测载药率。 3.通过半透膜透析实验检测Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs的体外药物释放和水解机制。 4.使用过氧化氢检测试剂盒测定NPs处理活化小鼠巨噬细胞Raw264.7内H2O2的含量。 5.通过激光共聚焦检测小鼠巨噬细胞Raw264.7和人成纤维滑膜细胞MH7A对Cy5标记的NPs的摄取情况。 6.采用qPCR实验检测MH7A细胞中三种FRs的mRNAs水平，WB实验检测Raw264.7和MH7A细胞中三种FRs的蛋白水平。 7.Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs处理活化的Raw264.7细胞后，采用qPCR检测iRhom2的mRNA表达水平，WB检测iRhom2、TNF-α和BAFF的蛋白的表达水平。 8.采用CCK-8实验检测Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs对Raw264.7细胞的细胞活性。 9.通过观察给药治疗后CIA小鼠体重、血常规检测和主要内脏器官的Hamp;E染色，评价Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs的体内生物安全性。 10.采用活体成像系统检测Cy5标记的Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs在CIA小鼠体内的关节炎症靶向性和生物学分布。 11.通过观察CIA小鼠给药治疗后的足掌厚度、AI指数和直接拍照观察，评价Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs在CIA小鼠的体内抗炎效果。 12.通过Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs给药治疗后小鼠足掌关节的micro-CT、Hamp;E和番红O染色，观察给药治疗后CIA小鼠的关节滑膜损伤和软骨侵蚀情况。 13.通过ELISA检测CIA小鼠给药治疗后血清中细胞因子TNF-α和BAFF的表达。 14.通过WB检测CIA小鼠给药治疗后关节组织蛋白中促炎基因iRhom2、TNF-α和BAFF的蛋白的表达水平。 研究结果： 1.成功制备了形态规则、大小均一、200nm左右的球形纳米颗粒，包括不载药的ROS响应性纳米颗粒(Blank/Oxi-αCDNPs)、负载Dex的ROS响应性纳米颗粒(Dex/Oxi-αCDNPs)、FA修饰的负载Dex的ROS响应性纳米颗粒(Dex/FA-Oxi-αCDNPs)以及Cy5标记的Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs。 2.半透膜透析实验表明Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs在H2O2溶液中加速降解，且其可显著降低活化Raw264.7细胞内H2O2的含量。 3.FRβ在Raw264.7细胞中的表达明显高于MH7A细胞，激光共聚焦检测证实Raw264.7细胞以时间依赖的方式有效摄取Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs，且摄取Dex/FA-Oxi-αCDNPs能力更强，而MH7A细胞对NPs的摄取能力明显弱于Raw264.7细胞。 4.Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs以剂量依赖的方式显著抑制活化Raw264.7细胞中iRhom2RNA的表达以及iRhom2、TNF-α和BAFF蛋白的表达，但不同浓度的Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs对Raw264.7细胞活性无明显影响。 5.Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs在CIA小鼠中具有良好的生物安全性，Dex/FA-Oxi-αCDNPs积聚在CIA小鼠关节炎症部位能力最强且持续时间更久。 6.Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs治疗后明显减轻CIA小鼠关节的滑膜炎症和软骨侵蚀，且Dex/FA-Oxi-αCDNPs治疗效果更佳。 7.Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs治疗CIA小鼠后显著降低血清TNF-α和BAFF水平，且抑制CIA小鼠关节中iRhom2、TNF-α和BAFF蛋白的表达，Dex/FA-Oxi-αCDNPs的抑制效果更显著。 结论： 1.成功制备了负载Dex的ROS响应纳米颗粒(Dex/Oxi-αCDNPs)、FA修饰的负载Dex的ROS响应纳米颗粒(Dex/FA-Oxi-αCDNPs)以及Cy5标记的Dex/Oxi-αCDNPs和Dex/FA-Oxi-αCDNPs。 2.Dex/FA-Oxi-αCDNPs能主动靶向活化Raw264.7细胞中的FRs而被摄取，并能够有效地清除活化Raw264.7细胞内升高的H2O2，使NPs的球形结构崩塌释放Dex，释放的Dex通过抑制iRhom2、TNF-α和BAFF的表达而抗炎。 3.CIA小鼠体内实验证明Dex/FA-Oxi-αCDNPs具有良好的体内安全性和主动靶向性，可通过主动靶向到达炎症关节部位，并通过抑制iRhom2/TNF-α/BAFF信号通路缓解CIA小鼠关节的滑膜损伤和软骨侵蚀，发挥抗炎作用。表明Dex/FA-Oxi-αCDNPs可作为RA治疗的新型候选策略。
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