摘要
目的本研究通过手术方法建立大鼠急性肾损伤实验模型，检测各组动物血清中血清肌酐和尿素氮的浓度差异，并进行肾小管损伤评分，分析缺血后处理对肾脏功能和结构的影响，初步判断缺血后处理对急性肾损伤的保护作用。检测内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP以及细胞凋亡蛋白CleavedCaspase3的表达，分析内质网应激和细胞凋亡与缺血后处理减轻急性肾损伤的相关性。 方法动物实验模型分3组：假手术(Sham)组、缺血再灌注(IschemiaReperfusion，IR)组、缺血后处理(IschemicPostconditioning，IPO)组。使用SD雄性大鼠，体重180-200g左右，共36只。各组大鼠开腹手术操作24小时后，收集下腔静脉血，检测血清肌酐和尿素氮的浓度并评估肾功能；对肾脏组织进行石蜡包埋后，应用苏木素-伊红染色（HE）技术，观察组织形态变化;光学显微镜下分别对Sham组、IR组和IPO组的组织形态变化进行肾小管损伤评分，分析缺血后处理对肾小管损伤程度的影响；免疫组织化学技术和蛋白质免疫印迹技术检测CleavedCaspase3在Sham组、IR组和IPO组的肾脏中的表达，观察缺血后处理对细胞凋亡的影响；通过TUNEL染色技术观察缺血后处理如何影响Sham组、IR组和IPO组的肾脏中细胞凋亡、坏死的情况;免疫荧光技术分别检测GRP78和CHOP在Sham组、IR组和IPO组中的表达，评估缺血后处理对内质网应激的调控作用。 结果血清肌酐和尿素氮检测结果显示，在Sham组、IR组和IPO组血清肌酐和尿素氮浓度变化显著（F=202.726,P＜0.001；F=496.013,P＜0.001），组间两两比较结果显示，IR组血清肌酐和尿素氮浓度明显高于Sham组；IPO组血清肌酐和尿素氮浓度低于IR组（P值均为P＜0.05）；说明缺血后处理可能改善了肾功能。HE染色结果提示，在Sham组，肾脏形态结构正常；IR组肾脏损伤严重，肾皮质区的肾小管上皮细胞水肿，出现大量空泡，并有大量上皮细胞脱落到管腔内，血管球内毛细血管严重淤血，间质充血；相对于IR组，IPO组肾脏损伤较轻，肾小管上皮细胞轻微水肿，有很小部分出现空泡变性现象，血管球内的毛细血管轻微淤血。肾小管损伤评分结果说明，肾小管损伤程度的组间差异明显（F=61.439，P＜0.001），组间比较结果表明，IR组明显高于Sham组；IPO组明显低于IR组；（P值均为P＜0.05）。这些结果表明，缺血后处理可以减轻肾组织损伤。TUNEL染色结果说明，Sham组、IR组和IPO组细胞阳性表达率差异明显（F=92.818,P＜0.001），Sham组有极少阳性表达；IR组中呈强阳性表达且明显高于Sham组（P＜0.05）；IPO组阳性表达明显低于IR组（P值均为P＜0.05）。免疫组织化学技术和蛋白质免疫印迹技术结果显示，CleavedCaspase3在不同组的阳性表达量差异明显（F=195.804,P＜0.001；F=439.230,P＜0.001）,Sham组肾小管上皮细胞胞质有极少阳性表达，属于正常生理性的细胞凋亡；IR组中大量肾小管上皮细胞胞质呈现棕黄色；IPO组肾小管上皮细胞胞质有少量阳性表达。Sham组肾脏中CleavedCaspase3表达量极少；IR组中CleavedCaspase3表达量明显高于Sham组（P＜0.05）；IPO组CleavedCaspase3表达量低于IR组（P值均为P＜0.05）。免疫荧光实验中，以E-Cadherin为参照，提示肾小管细胞的完整性，结果发现，肾小管上皮细胞中GRP78和CHOP的荧光信号，在Sham组几乎没有；IR组荧光增强，同时面积较大；IPO组荧光信号强度低于IR组，说明内质网应激水平影响着细胞凋亡程度。 结论肾缺血再灌注损伤后，CleavedCaspase3表达增加，内质网应激相关因子GRP78和CHOP表达较高，说明内质网发生应激反应且强度大，肾小管上皮细胞大量凋亡，组织受损严重。经缺血后处理，CleavedCaspase3表达减少，内质网应激相关因子GRP78和CHOP表达下降，说明缺血后处理可以降低内质网应激强度，减少细胞的凋亡，维持肾小管上皮细胞的结构和功能，减小肾组织的损伤程度。本实验为后续深入研究缺血后处理的保护作用机制和寻找抗肾脏缺血再灌注损伤作用的靶点提供实验依据。
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