摘要
研究目的：鼓室硬化（tympanosclerosis，TS）是急慢性中耳炎的常见后遗症，其病理改变主要表现为中耳黏膜固有层发生的纤维化及钙化病变。转化生长因子-β1（TGF-β1）是中耳炎与鼓室硬化中研究较多、较为关注的细胞因子之一，该因子在鼓室硬化的形成过程中呈现逐渐增高的趋势，是导致纤维化发生的重要因素，但具体的作用机制仍不明确。上皮间质转化（epithelial–mesenchymaltransformation,EMT）是促进炎症向纤维化进展的重要机制，TGF-β1是其关键的诱导因子。但TGF-β1是否介导EMT在鼓室硬化的发病机制中发挥作用目前未有研究。本次研究通过建立大鼠鼓室硬化模型和中耳上皮细胞原代培养探讨TGF-β1介导的EMT在鼓室硬化发病机制中的作用。 研究方法：本次研究共选用40只6-8周龄的健康雄性SpragueDawley大鼠，其中30只大鼠用于建立鼓室硬化模型，具体方法为右耳单次注射浓度为1×108CFU/ml的灭活肺的炎链球菌悬液50μl。造模8周后处死大鼠并取出双耳听泡。取中耳黏膜制成石蜡切片后进行Hamp;E染色和vonKossa染色，观察中耳黏膜的形态学改变及钙沉积情况。收集中耳黏膜进行Westernblotting检测，确定TGF-β1及EMT相关蛋白的表达。同时，收集10只正常8周龄雄性SD大鼠中耳黏膜，进行上皮细胞原代培养。原代细胞培养48小时后分为TGF-β1激活组和TGF-β1抑制组，其中激活组细胞使用TGF-β1刺激48小时，抑制组首先采用TGF-β受体Ⅰ/Ⅱ型抑制剂处理细胞6小时，后用与刺激组相同浓度的TGF-β1刺激细胞48小时，分别收集激活组和抑制组细胞进行Westernblotting和免疫荧光染色，分析两组细胞中EMT相关蛋白的表达情况。 研究结果： 1、造模8周时通过耳显微镜观察发现，72.4%的用肺炎链球菌造模的SD大鼠右耳鼓膜的锤骨柄周围出现白色钙化病变；对侧未处理左耳均未出现钙化斑块，鼓膜结构清晰。 2、Hamp;E染色提示发生鼓室硬化的大鼠的中耳黏膜有明显的炎性细胞浸润和纤维化，对侧未处理左耳的中耳黏膜形态结构正常，未见炎症或纤维化改变。 3、vonKossa染色提示鼓室硬化黏膜中存在钙质颗粒的沉积；对侧未处理左耳未见钙质颗粒的沉积。 4、在大鼠中耳黏膜的Westernblotting实验中，与对照组相比，鼓室硬化大鼠中耳黏膜中TGF-β1以及snail、N-钙粘蛋白、纤维连接蛋白等间充质细胞标志物表达增加，上皮细胞标志物E-钙粘蛋白表达降低。 5、在利用中耳上皮细胞进行的体外实验中，我们证实TGF-β1可以激活中耳黏膜上皮细胞中的EMT通路，导致snail、纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白的表达量增加，同时使E-钙粘蛋白的表达降低。而当我们使用TGF-β1受体抑制剂抑制TGF-β1的传导时，EMT相关蛋白的表达水平降低。同时我们通过免疫荧光染色证实，使用TGF-β1刺激中耳上皮细胞时促进了EMT的关键标志物-波形蛋白的表达增高。 研究结论： 鼓室内注射灭活肺炎链球菌是一种建立鼓室硬化模型的安全、可靠的方法；TGF-β1可促进动物模型的中耳炎症向纤维化进展，是促进鼓室硬化形成的关键因子；TGF-β1介导的EMT在鼓室硬化的发病机制中起重要作用。
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