摘要
目的 探究混合菌种发酵法制备花生粕胰脂肪酶抑制剂的发酵工艺条件，并进一步探究其对高脂饮食小鼠脂代谢和肠道屏障功能的影响及可能的作用机制。 方法 1、以胰脂肪酶抑制率为指标，通过单因素实验和正交试验对红曲霉和纳豆芽孢杆菌混合发酵花生粕的发酵温度、发酵时间、菌种接种量和菌种比例进行优化，探究混菌发酵花生粕胰脂肪酶抑制剂的最佳发酵工艺条件。 2、60只C57BL/6J小鼠随机分为6组（10只/组）：空白对照组（N）；模型组（M）；阳性对照组（Ato，阿托伐他汀10mg/kg）；未发酵花生粕组（NF，150mg/kg）；花生粕发酵物低剂量组（FL，50mg/kg）；花生粕发酵物高剂量组（FH，150mg/kg）。N组基础饲料喂养，其余组高脂饲料喂养，实验持续6周。实验结束后摘眼球处死小鼠，测定血清中脂质、瘦素、葡萄糖、谷丙转氨酶（Alanineaminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartateaminotransferase,AST）含量，取肝脏和回肠组织进行病理学观察，测量小鼠回肠绒毛高度，利用免疫印迹实验（WesternBlot）检测小鼠回肠紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达。 结果 1、花生粕发酵物（FPM）对胰脂肪酶的抑制作用优于未发酵花生粕（NFPM），且混合菌种发酵的效果优于单菌。确定最优发酵工艺条件为：温度31℃，时间34h，接种量6%，菌种比例（红曲霉：纳豆芽孢杆菌）为1:2。在此条件下FPM对胰脂肪酶的抑制作用达到96.17±0.47%，与NFPM相比抑制率增加了46.23%。 2、与基础饮食的N组相比，高脂饮食的各组小鼠食物摄入量均显著降低（P＜0.05），但高脂饮食各组小鼠之间无显著差异（P＞0.05）。与N组相比，M组小鼠体重和Lee''s指数显著增加（P＜0.05）。除了NF组，其余各组小鼠体重和Lee''s指数较M组均显著降低（P＜0.05）。 3、与N组相比，M组小鼠血清总胆固醇（Totalcholesterol,TC），甘油三酯（Triglycerides,TG）和低密度脂蛋白胆固醇（Low-densitylipoproteincholesterol,LDL-C）水平分别升高了21.55%、25%和106.67%，高密度脂蛋白胆固醇（High-densitylipoproteincholesterol,HDL-C）水平降低了50.36%（P＜0.05）。与M组相比，Ato和FH组小鼠血清TC，TG，LDL-C水平均显著降低，HDL-C水平显著升高（P＜0.05），但NF组TG和HDL-C水平与M组相比无显著差异（P＞0.05）。 4、与N组相比，M组小鼠血清瘦素和葡萄糖水平分别升高了81.32%和59.3%。与M组相比，FL组小鼠血清瘦素和葡萄糖水平分别降低了22.82%和16.58%，FH组小鼠血清瘦素和葡萄糖水平分别降低了34.07%和21.47%。重要的是，FH组血清瘦素水平与Ato组和NF组相比分别降低了14.75%和25.45%（P＜0.05）。 5、与N组相比，M组小鼠血清ALT和AST水平分别升高了99.54%和138.36%。与M组相比，FL组小鼠血清ALT和AST水平分别降低了24.87%和28.50%，FH组小鼠血清ALT和AST水平分别降低了34.54%和37.60%。肝脏苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色显示，与N组相比，M组小鼠肝细胞形态不完整，肝索排列紊乱，胞质内充满许多脂肪小空泡。与M组相比，其余各组对于上述现象均有不同程度的改善，但NF组仍存在少量脂肪空泡，改善效果不如其余组明显。 6、回肠HE染色显示，与N组相比，M组小鼠回肠绒毛缩短脱落。其余各组较M组均有不同程度的改善，其中FH组改善效果最好，绒毛整齐完好，绒毛高度增加。WesternBlot结果显示，与N组相比，M组小鼠回肠紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达水平分别降低了52.22%和60.92%（P＜0.05）。与M组相比，FL组小鼠回肠紧密连接蛋白ZO-1的表达水平增加了58.14%（P＜0.05），但Occludin水平无显著差异（P＞0.05），FH组小鼠回肠紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达水平分别增加了67.44%和88.24%（P＜0.05）。有趣的是，我们发现与M组相比，Ato组小鼠ZO-1和Occludin表达水平均无显著差异（P＞0.05）。 结论 1、FPM对胰脂肪酶的抑制作用优于NFPM，确定最优发酵工艺条件为温度31℃，时间34h，接种量6%，菌种比例（红曲霉：纳豆芽孢杆菌）为1:2，在此条件下制备的FPM对胰脂肪酶的抑制作用达到96.17±0.47%。 2、FPM对高脂饮食小鼠的脂质代谢有一定的调节作用。其机制可能与抑制胰脂肪酶的活性，改善瘦素抵抗，保护肠粘膜屏障有关。
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